Введение
Лабораторный метод измерения ферментативной активности
Ферментные анализы – это лабораторные методы для измерения активности ферментов. Они необходимы для изучения кинетики ферментов и ингибирования ферментов.
Энзимные единицы
Количество или концентрация фермента может быть выражена в молярных количествах, как и любое другое химическое вещество, или в единицах активности фермента.
Специфическая деятельность
Специфическая активность фермента – еще одна распространенная единица измерения. Она представляет собой активность фермента на миллиграмм общего белка (выражается в мкмоль мин⁻¹ мг⁻¹). Специфическая активность позволяет оценить чистоту фермента в смеси. Это количество микромолей продукта, образованного ферментом за определенное время (в минутах) при заданных условиях, приходящееся на миллиграмм общего белка. Специфическая активность равна скорости реакции, умноженной на объем реакции и деленной на массу общего белка. Единицей СИ является каталь/кг, однако более практичной единицей является мкмоль/мг·мин. Специфическая активность является мерой процессивности фермента (способности фермента эффективно катализировать реакцию) при определенной (обычно насыщающей) концентрации субстрата и обычно постоянна для чистого фермента. Для устранения погрешностей, возникающих из-за различий между партиями культивирования и/или неправильно свернутых ферментов и подобных проблем, можно провести титрование активных центров. Это измерение количества активного фермента, рассчитанное, например, путем титрования количества активных центров с использованием необратимого ингибитора. Специфическая активность должна быть выражена в мкмоль мин⁻¹ мг⁻¹ активного фермента. Если известна молекулярная масса фермента, то из специфической активности можно рассчитать число оборотов – количество микромолей продукта, образующихся в секунду на микромоль активного фермента. Число оборотов можно представить как количество каталитических циклов, выполняемых каждой молекулой фермента в секунду.
Связанная терминология
Скорость реакции – это изменение концентрации исчезающего субстрата (или образующегося продукта) за единицу времени (моль/л·с). Процент чистоты рассчитывается как 100% × (удельная активность образца фермента / удельная активность чистого фермента). Нечистый образец имеет более низкую удельную активность, поскольку часть его массы не является ферментом. Если известна удельная активность 100% чистого фермента, то удельная активность нечистого образца будет ниже, что позволяет рассчитать чистоту и получить достоверный результат.
Типы анализов
Все ферментные анализы измеряют либо потребление субстрата, либо образование продукта с течением времени. Существует большое количество различных методов измерения концентраций субстратов и продуктов, и многие ферменты могут быть исследованы несколькими различными способами. Биохимики обычно изучают ферментативно-каталитические реакции, используя четыре типа экспериментов:
Эксперименты с начальной скоростью. При смешивании фермента с большим избытком субстрата, промежуточный комплекс фермент-субстрат быстро накапливается на начальной стадии переходного процесса. Затем реакция достигает стационарной кинетики, при которой концентрация промежуточного комплекса фермент-субстрат остается приблизительно постоянной с течением времени, а скорость реакции изменяется относительно медленно. Скорость измеряется в течение короткого периода после достижения квазистационарного состояния, как правило, путем мониторинга накопления продукта с течением времени. Поскольку измерения проводятся в течение очень короткого периода времени и из-за большого избытка субстрата, можно сделать приближение, что количество свободного субстрата приблизительно равно количеству исходного субстрата. Эксперимент с начальной скоростью является самым простым в проведении и анализе, поскольку он относительно свободен от осложнений, таких как обратная реакция и деградация фермента. Поэтому это наиболее часто используемый тип эксперимента в кинетике ферментов. Эксперименты с кривой прогресса. В этих экспериментах кинетические параметры определяются на основе выражений для концентраций компонентов как функции времени. Концентрация субстрата или продукта регистрируется с течением времени после начального быстрого переходного процесса и в течение достаточно длительного периода, чтобы реакция приблизилась к равновесию. Эксперименты с кривой прогресса широко использовались на ранних этапах изучения кинетики ферментов, но в настоящее время используются реже. Эксперименты с переходной кинетикой. В этих экспериментах поведение реакции отслеживается в течение начального быстрого переходного процесса, когда промежуточный продукт достигает стационарного состояния. Эти эксперименты сложнее в выполнении, чем два вышеописанных класса, поскольку они требуют специализированных методов (таких как фотолиз защищенных соединений) или быстрого смешивания (таких как метод остановленного потока, тушения потока или непрерывного потока). Эксперименты релаксации. В этих экспериментах равновесная смесь фермента, субстрата и продукта подвергается возмущению, например, скачку температуры, давления или pH, и наблюдается возвращение к равновесию. Анализ этих экспериментов требует учета полностью обратимой реакции. Кроме того, эксперименты релаксации относительно нечувствительны к механистическим деталям и, следовательно, обычно не используются для идентификации механизма, хотя они могут быть применены в соответствующих условиях. Ферментные анализы можно разделить на две группы в зависимости от метода отбора проб: непрерывные анализы, при которых анализ обеспечивает непрерывное измерение активности, и дискретные анализы, при которых отбираются пробы, реакция останавливается, а затем определяется концентрация субстратов/продуктов.
Непрерывные анализы
Наиболее удобны непрерывные методы анализа, поскольку один метод позволяет определить скорость реакции без каких-либо дополнительных действий. Существует множество различных типов непрерывных методов анализа.
Флуорометрическая
Флуоресценция – это явление, при котором молекула излучает свет одной длины волны после поглощения света другой длины волны. Флюорометрические анализы используют разницу в флуоресценции субстрата и продукта для измерения скорости ферментативной реакции. Эти анализы, как правило, значительно более чувствительны, чем спектрофотометрические, но могут быть подвержены помехам, вызванным примесями и нестабильностью многих флуоресцентных соединений под воздействием света. Примером таких анализов является использование нуклеотидных коферментов NADH и NADPH, где восстановленные формы флуоресцируют, а окисленные – нет. Таким образом, реакции окисления можно отслеживать по уменьшению флуоресценции, а реакции восстановления – по ее увеличению. Также существуют синтетические субстраты, высвобождающие флуоресцентный краситель в ферментативно-катализируемой реакции, например, 4-метилумбеллиферил-β-D-галактозид для определения активности β-галактозидазы или 4-метилумбеллиферилбутират для определения активности липазы Candida rugosa.
Калориметрическая
Калориметрия – это измерение тепла, выделяемого или поглощаемого в ходе химических реакций. Эти методы очень универсальны, поскольку многие реакции сопровождаются изменением теплоты, а для использования микрокалориметра требуется небольшое количество фермента или субстрата. Эти методы позволяют измерять реакции, которые невозможно определить каким-либо другим способом.
Химиолюминесцентные
Химилюминесценция — это излучение света в результате химической реакции. Некоторые ферментативные реакции производят свет, который можно измерить для определения образования продукта. Такие анализы могут быть чрезвычайно чувствительными, поскольку свет, который они излучают, можно регистрировать на фотопленке в течение дней или недель, однако его количественная оценка может быть затруднена, так как не весь свет, выделяемый реакцией, удается обнаружить. Обнаружение хрена пероксидазы с помощью ферментативной химилюминесценции (ECL) — распространенный метод выявления антител при вестерн-блоттинге. Другой пример — фермент люцифераза, содержащийся в светлячках, который естественным образом производит свет из своего субстрата люциферина.
Рассеивание света
Статическое рассеяние света измеряет произведение молярной массы, усредненной по весу, и концентрации макромолекул в растворе. При фиксированной общей концентрации одного или нескольких компонентов в течение времени измерения, сигнал рассеяния является прямым измерением молярной массы, усредненной по весу, раствора, которая изменяется при образовании или диссоциации комплексов. Таким образом, измерение позволяет количественно определить стехиометрию комплексов, а также кинетику их образования и распада. Анализ кинетики белков методом рассеяния света – это универсальная методика, не требующая использования ферментов.
Микромасштабный термофорез
Микромасштабный термофорез (МСТ) измеряет размер, заряд и энтропию гидратации молекул/субстратов в состоянии равновесия. Термофоретическое движение флуоресцентно меченого субстрата значительно изменяется при его модификации ферментом. Эту ферментативную активность можно измерять с высоким временным разрешением в реальном времени. Материальные затраты полностью оптического метода МСТ очень низки: для измерения констант скорости ферментативной реакции для определения активности и ингибирования требуется всего 5 мкл объема образца и концентрация фермента 10 нМ. МСТ позволяет аналитикам измерять модификацию двух различных субстратов одновременно (мультиплексирование), если оба субстрата помечены разными флюорофорами. Таким образом, можно проводить эксперименты по конкуренции субстратов.
Непрерывные анализы
Дискретные анализы – это когда образцы из ферментативной реакции берутся через определенные промежутки времени, и в этих образцах измеряется количество образовавшегося продукта или потребленного субстрата.
Радиометрические
Радиометрические анализы измеряют включение радиоактивности в субстраты или её высвобождение из субстратов. Наиболее часто используемыми радиоактивными изотопами в этих анализах являются 14C, 32P, 35S и 125I. Поскольку радиоактивные изотопы позволяют специфически метить отдельный атом субстрата, эти анализы отличаются высокой чувствительностью и специфичностью. Они широко применяются в биохимии и зачастую являются единственным способом измерения конкретной реакции в грубых экстрактах (сложные смеси ферментов, получаемые при лизе клеток). Радиоактивность в этих процедурах обычно измеряется с помощью сцинтилляционного счетчика.
Хроматографические
Хроматографические анализы измеряют образование продукта, разделяя реакционную смесь на компоненты с помощью хроматографии. Обычно это выполняется с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), но также может использоваться более простая техника – тонкослойная хроматография. Хотя для этого подхода может потребоваться значительное количество материала, его чувствительность можно повысить, маркируя субстраты/продукты радиоактивной или флуоресцентной меткой. Чувствительность анализа также была увеличена за счет перехода к более совершенным хроматографическим приборам (например, жидкостной хроматографии сверхвысокого давления), которые работают при давлении насоса в несколько раз выше, чем у приборов ВЭЖХ (см. Высокоэффективная жидкостная хроматография#Давление насоса).
Факторы, влияющие на анализы
На результаты анализа влияет несколько факторов, и недавний обзор обобщает различные параметры, которые необходимо отслеживать для поддержания работоспособности анализа.
Концентрация соли
Большинство ферментов не выдерживают экстремально высоких концентраций соли. Ионы нарушают образование слабых ионных связей в белках. Обычно ферменты активны при концентрации соли 1500 мМ. Однако, как и всегда, существуют исключения, например, галофильные водоросли и бактерии.
Влияние температуры
Все ферменты работают в пределах температурного диапазона, специфичного для организма. Повышение температуры обычно приводит к увеличению скорости реакции. Однако существует предел этого увеличения, так как более высокие температуры вызывают резкое снижение скорости реакции. Это происходит из-за денатурации (изменения) структуры белка, вызванной разрушением слабых ионных и водородных связей, которые стабилизируют трехмерную структуру активного центра фермента. "Оптимальная" температура для человеческих ферментов обычно находится в диапазоне от 35 до 40 °C. Средняя температура тела человека составляет 37 °C. Человеческие ферменты начинают быстро денатурироваться при температурах выше 40 °C. Ферменты термофильных архей, обитающих в горячих источниках, стабильны при температурах до 100 °C. Однако представление об "оптимальной" скорости ферментативной реакции может быть обманчивым, поскольку наблюдаемая скорость при любой температуре является результатом двух скоростей: скорости реакции и скорости денатурации. Если использовать метод анализа, измеряющий активность в течение одной секунды, то будут получены высокие значения активности при высоких температурах. Однако, если использовать метод анализа, измеряющий образование продукта в течение часа, то при этих температурах активность будет низкой.
Влияние рН
Большинство ферментов чувствительны к pH и имеют определенные диапазоны активности. У каждого есть оптимальный pH. pH может остановить активность фермента, вызывая денатурацию (изменение) его трехмерной структуры путем разрыва ионных и водородных связей. Большинство ферментов функционируют в диапазоне pH от 6 до 8, однако пепсин в желудке наиболее эффективен при pH 2, а трипсин – при pH 8.
Насыщенность субстрата
Повышение концентрации субстрата увеличивает скорость реакции (активность фермента). Однако насыщение фермента ограничивает скорость реакции. Фермент считается насыщенным, когда активные центры всех его молекул заняты большую часть времени. В точке насыщения дальнейшее увеличение концентрации субстрата не приведет к увеличению скорости реакции. График скорости реакции достигнет плато.
Уровень перенаселения
Большое количество макромолекул в растворе влияет на скорости и константы равновесия ферментативных реакций посредством эффекта, известного как макромолекулярное сгущение.