Кальцийге сезімтал фотопротеин: Аэкориннің зерттелуі мен қасиеттері
Aequorin
Аэкорин – кальцийге сезімтал фотопротеин, Aequorea victoria медузасынан бөлінген. Биолюминесценция, жасыл флуоресценттік ақуызбен байланысы, Prevagen құрамында қолданылады.
Ағылшыншамен салыстырыңыз: абзацты басыңыз — түпнұсқа терезеде ашылады. Абзац астындағы EN түймесі оны мәтін ішінде көрсетеді.
Мазмұны
Кіріспе
Кальций белсенді фотопротеин
Calcium activated photoprotein
Aequorin – Aequorea victoria гидрозоясынан оқшауланған кальций белсенді фотопротеин. Оның биолюминесценциясы 1962 жылы Осаму Шимомураның жануардан ақуызды оқшаулауынан бұрын көп жылдар зерттелген. Жануарда ақуыз жасыл флуоресцентті ақуызбен бірге резонанстық энергия алмасу арқылы жасыл жарық шығарады, ал aequorin өздігінен көк жарық шығарады. "Желкенді ДНК" туралы пікірталас көбінесе "жарықтандыратын" жануарларды жасауға қатысты трансгенді жануарларға сілтеме жасайды, олар жасыл флуоресцентті ақуызды экспрессиялайды, aequorin емес, бірақ екеуі де бастапқыда бір жануардан алынған. Aequorin ақуызының бөлігі – апоaequorin, ол Prevagen диеталық қоспасының құрамына кіреді. АҚШ Федералды сауда комиссиясы (FTC) өндірушіні жадты жақсарту туралы жалған жарнама жасады деп айыптады.
Aequorin is a calcium activated photoprotein isolated from the hydrozoan Aequorea victoria. Its bioluminescence was studied decades before the protein was isolated from the animal by Osamu Shimomura in 1962. In the animal, the protein occurs together with the green fluorescent protein to produce green light by resonant energy transfer, while aequorin by itself generates blue light. Discussions of "jellyfish DNA" that can make "glowing" animals often refer to transgenic animals that express the green fluorescent protein, not aequorin, although both originally derive from the same animal. Apoaequorin, the protein portion of aequorin, is an ingredient in the dietary supplement Prevagen. The US Federal Trade Commission (FTC) has charged the maker with false advertising for its memory improvement claims.
Ашылу
Ээкоринді зерттеуді 1921 жылы Э. Ньютон Харви бастаған. Харви классикалық люцифераза-люциферин реакциясын көрсетуге қойғанымен, судың құрғақ фотоциттерден жарық шығара алатынын және оттегі болмаған жағдайда да жарық тудыра алатынын көрсетті. Кейін 1961 жылы Осаму Шимомура Aequorea биолюминесценциясын зерттеуге кірісті. Бұл жұмысқа Вашингтон штатының Фрейди Харбор қаласындағы портынан ондаған мыңдаған медузаларды шаршатып жинау қажет болды. Оның жұмысының негізгі бағыты биолюминесценция болғанымен, Шимомура және тағы екеуі, Мартин Чалфи және Роджер Цзиен, 2008 жылы жасыл флуоресцентті ақуыздарға жасаған еңбектері үшін Нобель сыйлығымен марапатталды.
Work on aequorin began with E. Newton Harvey in 1921. Though Harvey was unable to demonstrate a classical luciferase luciferin reaction, he showed that water could produce light from dried photocytes and that light could be produced even in the absence of oxygen. Later, Osamu Shimomura began work into the bioluminescence of Aequorea in 1961. This involved tedious harvesting of tens of thousands of jellyfish from the docks in Friday Harbor, Washington. While the main focus of his work was on the bioluminescence, Shimomura and two others, Martin Chalfie and Roger Tsien, were awarded the Nobel Prize in 2008 for their work on green fluorescent proteins.
Құрылымы
Ээкуорин – екі бөлек бірліктен тұратын голопротеин, оның ішінде апоэкуорин деп аталатын апопротеин, молекулалық салмағы шамамен 21 кДа, және люциферин – протездік топ коэлентеразин. Яғни, апоэкуорин – жануардың фотоциттерінде түзілетін фермент, ал коэлентеразин – ферменттің катализдейтін субстраты, оның тотығуы. Коэлентеразин байланысқан кезде, ол ээкуорин деп аталады. Маңыздысы, бұл протеин Ca2+ иондарын байланыстыру орындары ретінде жұмыс істейтін үш EF қол мотивін қамтиды. Протеин кальций байланыстыратын белоктардың суперавтобасының мүшесі болып табылады, оның 66-ға жуық кіші отбасылары бар. Кристалдық құрылымы ээкуориннің коэлентеразин мен оттегіні перекис түрінде, коэлентеразин 2 гидропероксид ретінде байланыстыратынын көрсетті. Бірінші екі кальций атомының байланысу орны үшінші орынға қарағанда кальцийге 20 есе артық сәйкес келеді. Дегенмен, тек екі EF қол ғана кальцийді байланыстырады деген бұрынғы мәлімдемелер кейінгі құрылымдардың барлық үш орынның кальцийді байланыстыра алатынын көрсетуімен күмәндандырылды. Титрлеу зерттеулері кальций байланыстырудың барлық үш орнының белсенді екенін, бірақ ферменттік реакцияны іске қосу үшін тек екі ион қажет екенін көрсетті. Басқа зерттеулер ээкуориннің құрылымын сақтайтын ішкі цистеин байланысының бар екенін көрсетті. Бұл белокты жаңарту үшін бета-меркаптоэтанол сияқты тиолдық реагенттің қажеттілігін де түсіндіреді, себебі мұндай реагенттер цистеин қалдықтары арасындағы сульфгидрилдік байланыстарды әлсіретіп, ээкуориннің жаңартуын жеделдетеді. Ээкуориннің химиялық сипаттамасы протеиннің қатал өңдеулерге біршама төзімді екенін көрсетеді. Ээкуорин жылуға төзімді. 95 °C температурада 2 минут бойы сақталғанда протеин белсенділігінің тек 25% жоғалды. 6 М мочевина немесе 4 М гуанидин гидрохлориді сияқты денатурациялаушы заттар протеинды жойған жоқ.
Aequorin is a holoprotein composed of two distinct units, the apoprotein that is called apoaequorin, which has an approximate molecular weight of 21 kDa, and the prosthetic group coelenterazine, the luciferin. This is to say, apoaequorin is the enzyme produced in the photocytes of the animal, and coelenterazine is the substrate whose oxidation the enzyme catalyzes. When coelenterazine is bound, it is called aequorin. Notably, the protein contains three EF hand motifs that function as binding sites for Ca2+ ions. The protein is a member of the superfamily of the calcium binding proteins, of which there are some 66 subfamilies. The crystal structure revealed that aequorin binds coelenterazine and oxygen in the form of a peroxide, coelenterazine 2 hydroperoxide. The binding site for the first two calcium atoms show a 20 times greater affinity for calcium than the third site. However, earlier claims that only two EF hands bind calcium were questioned when later structures indicated that all three sites can indeed bind calcium. Thus, titration studies show that all three calcium binding sites are active but only two ions are needed to trigger the enzymatic reaction. Other studies have shown the presence of an internal cysteine bond that maintains the structure of aequorin. This has also explained the need for a thiol reagent like beta mercaptoethanol in the regeneration of the protein since such reagents weaken the sulfhydryl bonds between cysteine residues, expediting the regeneration of the aequorin. Chemical characterization of aequorin indicates the protein is somewhat resilient to harsh treatments. Aequorin is heat resistant. Held at 95 °C for 2 minutes the protein lost only 25% activity. Denaturants such as 6 M urea or 4 M guanidine hydrochloride did not destroy the protein.
Генетика
Экорин, болжам бойынша, Aequorea геномында кодталған. Жануардан геннің кем дегенде төрт көшірмесі cDNA ретінде алынды. Геном тізбектелмегендіктен, cDNA варианттары ақуыздың барлық изоформаларын қамтамасыз ете алатыны белгісіз.
Aequorin is presumably encoded in the genome of Aequorea. At least four copies of the gene were recovered as cDNA from the animal. Because the genome has not been sequenced, it is unclear if the cDNA variants can account for all of the isoforms of the protein.
Әрекет ету механизмі
Э. Ньютон Харвидің Aequorea биолюминесценциясын зерттеуінің алғашқы кезеңдерінде, биолюминесценция қоңыраудың айналасында сақина тәрізді көрінетіні және тіпті ауа болмаған жағдайда да пайда болатыны байқалды. Бұл қызығушылық тудырды, себебі көптеген биолюминесценция реакцияларына оттегі қажет, және бұл жануарлар оттегіні бір жолмен сақтайды деген ойға әкелді. Кейіннен апопротеиннің коэлентеразин 2 гидропероксидін тұрақты түрде байланыстыра алатыны және аэкуриннің осы белсенді түріне қайта өңделуі үшін оттегі қажет екені анықталды. Дегенмен, кальций иондарының қатысуымен белок конформациялық өзгеріске ұшырап, өз протездік тобы – коэлентеразин 2 гидропероксидін, қозулы коэлентерамидке және CO2-ге айналдырады. Қозулы коэлентерамид негізгі күйге оралғанда, көк жарық (465 нм толқын ұзындығы) шығарылады. Коэлентерамид алмастырылмас бұрын, бүкіл ақуыз әлі де флуоресценттік көк түсті болып қалады. Биолюминесценция мен флуоресценция арасындағы байланыс болғандықтан, бұл қасиет люциферин – коэлентеразиннің табылуында маңызды рөл атқарды.
Early studies of the bioluminescence of Aequorea by E. Newton Harvey had noted that the bioluminescence appears as a ring around the bell, and occurs even in the absence of air. This was remarkable because most bioluminescence reactions require oxygen, and led to the idea that the animals somehow store oxygen. It was later discovered that the apoprotein can stably bind coelenterazine 2 hydroperoxide, and oxygen is required for the regeneration to this active form of aequorin. However, in the presence of calcium ions, the protein undergoes a conformational change and converts its prosthetic group, coelenterazine 2 hydroperoxide, into excited coelenteramide and CO2. As the excited coelenteramide relaxes to the ground state, blue light (wavelength of 465 nm) is emitted. Before coelenteramide is exchanged out, the entire protein is still fluorescent blue. because of the connection between bioluminescence and fluorescence, this property was ultimately important in the discovery of the luciferin coelenterazine.
Қолданбалар
Шығарылатын жарықты люминометрмен оңай анықтауға болатындықтан, аэкурин молекулалық биологияда жасушаішілік Ca2+ деңгейін өлшеу үшін пайдалы құралға айналды. Аэкуринді ерте сәтті тазарту, тірі жануарлардың тіндеріне ақуызды енгізу арқылы кальцийдің физиологиялық босатылуын балықшаның бұлшық ет талшықтарында бейнелеуге мүмкіндік берген алғашқы тәжірибелерге әкелді. Содан бері ақуыз зебра балықтары, егеуқұйрықтар, тышқандар және жасуша мәдениеттері сияқты көптеген модельдік биологиялық жүйелерде кеңінен қолданылып келеді. Аэкурин генін экспрессиялайтын жасуша мәдениеттері апоаэкуоринді тиімді синтездей алады; алайда, рекомбинантты экспрессия тек апопротеинді ғана береді. Сондықтан, функционалды ақуыз алу үшін жасушалар өсірілетін ортаға коэлентеразин қосу қажет, осылайша оның көк жарық шығаруын Ca2+ концентрациясын өлшеу үшін пайдалануға болады. Коэлентеразин гидрофобты молекула болғандықтан, өсімдіктер мен саңырауқұлақтардың жасуша қабырғаларынан, сондай-ақ жоғары эукариоттардың плазмалық мембранасынан оңай сіңіріледі, бұл аэкуриннің өсімдіктерде, саңырауқұлақтарда және сүтқоректілер жасушаларында Ca2+ репортері ретінде қолдануға жарамды етеді. Аэкурин басқа Ca2+ индикаторларынан бірнеше артықшылықтарға ие. Ақуыздың үлкен мөлшері липофильді бояуларға, мысалы DiI-ге қарағанда жасушалардан азырақ шығуына себеп болады. Кернеуге сезімтал бояуларда жиі кездесетін жасушаішілік бөліну немесе жинақталу құбылыстары болмайды және жасуша функцияларын немесе эмбриондық дамуды бұзбайды. Сонымен қатар, коэлентеразиннің тотығуынан шығатын жарық оптикалық стимуляцияға тәуелді емес, сондықтан автофлуоресценция мәселелері жоққа шығарылады. Аэкуриннің басты шектеуі – коэлентеразин протездік тобы жарық шығару үшін қайтымсыз тұтынылады, сондықтан ортаға коэлентеразинды үнемі қосу қажет. Мұндай мәселелер Роджер Цзиен және Оливер Грисбек әзірлеген тропонинге негізделген TN XXL сенсоры сияқты басқа генетикалық кодталған кальций сенсорларын дамытуға әкелді.
Since the emitted light can be easily detected with a luminometer, aequorin has become a useful tool in molecular biology for the measurement of intracellular Ca2+ levels. The early successful purification of aequorin led to the first experiments involving the injection of the protein into the tissues of living animals to visualize the physiological release of calcium in the muscle fibers of a barnacle. Since then, the protein has been widely used in many model biological systems, including zebrafish, rats, mice, and cultured cells. Cultured cells expressing the aequorin gene can effectively synthesize apoaequorin; however, recombinant expression yields only the apoprotein. Therefore it is necessary to add coelenterazine into the culture medium of the cells to obtain a functional protein and thus use its blue light emission to measure Ca2+ concentration. Coelenterazine is a hydrophobic molecule, and therefore is easily taken up across plant and fungal cell walls, as well as the plasma membrane of higher eukaryotes, making aequorin suitable as a Ca2+ reporter in plants, fungi, and mammalian cells. Aequorin has a number of advantages over other Ca2+ indicators. Because the protein is large, it has a low leakage rate from cells compared to lipophilic dyes such as DiI. It lacks phenomena of intracellular compartmentalization or sequestration as is often seen for Voltage sensitive dyes, and does not disrupt cell functions or embryo development. Moreover, the light emitted by the oxidation of coelenterazine does not depend on any optical excitation, so problems with auto fluorescence are eliminated. The primary limitation of aequorin is that the prosthetic group coelenterazine is irreversibly consumed to produce light, and requires continuous addition of coelenterazine into the media. Such issues led to developments of other genetically encoded calcium sensors including the calmodulin based sensor cameleon, developed by Roger Tsien and the troponin based sensor, TN XXL, developed by Oliver Griesbeck.
Маркетинг және құқықтық мәселелер
Апоаэкуорин – Quincy Bioscience компаниясы жадты сақтау үшін қосымша ретінде сататын "Prevagen" құрамындағы зат. 2017 жылы АҚШ Федералды сауда комиссиясы (FTC) өндірушіні өнімнің жадты жақсартатыны, танымдық мүмкіндіктер беретіні және «клиникалық тұрғыдан дәлелденгені» туралы жалған жарнама жасады деп айыптады. FTC-нің мәлімдемесіне сәйкес, «Prevagen сатушылары егде жастағы тұтынушылардың жасқа байланысты есте сақтау қабілетінің төмендеуінен қорқуын пайдаланды». Quincy компания айыптауға қарсы күресетінін мәлімдеді. Сотқа дейінгі клиникалық сынақтарда Quincy Bioscience компаниясының қызметкерлері «жад және танымға қатысты негізгі көрсеткіштер бойынша плацебомен салыстырғанда ешқандай жалпы пайданы анықтамады», ал компанияның жарнамасында аздаған жақсаруды көрсеткен бірнеше даулы кіші топтардың талдауы қателікпен келтірілген. Сот ісі (Spath және басқалар. v. Quincy Bioscience Holding Company, Inc. және басқалар, Іс № 18 cv 12416, D. NJ.) Аудандық сотта қарастырылмай қалды, бірақ шешімді жою туралы шағым берілді. Бұл талап Quincy Pharmaceuticals компаниясына қарсы басқа бір талаппен біріктірілді, Vanderwerff v. Quincy Bioscience (Іс № 17 cv 784, D. NJ), ол басшылық іс болды. 2019 жылдың 21 ақпанында АҚШ-тың екінші апелляциялық соты FTC мен Нью-Йорк штатының Quincy Bioscience компаниясына қарсы іс жүргізуге құқылы екенін шешті. Бұл бұйрық тараптар үш судьядан тұратын алқа алдында дауласып болғаннан кейін екі аптадан кем уақыт өткен соң шығарылды. Компанияның адвокаттары «зерттеуді аяқтаған 211 адамның барлығын қарастырғанда ешқандай статистикалық айырмашылық жоқ екенін мойындады». Сот компания адвокаттарының FTC саяси себептермен іс қозғады деген айыптамаларын қатаң түрде жоққа шығарды. 2020 жылдың 23 наурызында Флориданың оңтүстік округінің АҚШ округтік сотының федералды судьясы Prevagen-ді соңғы төрт жылда сатып алған тұтынушылар тобы үшін бүкіл ел бойынша топтық іс жүргізуді бекітетін есеп пен ұсынымдарды жариялады. Сот отырысы 2020 жылдың қазан айына белгіленді. Quincy Bioscience компаниясы Prevagen өнімдерінің ми саулығын қолдайтыны және есте сақтау қабілетінің жоғалуына көмектеседі деген мәлімдемесін бұрмалағанын мойындады. Келісім шарттарына сәйкес, 2007 жылдан 2020 жылдың 31 шілдесіне дейінгі сатып алулар үшін 2020 жылдың 26 қазанына дейін өтініш берген сатып алушылар 70 долларға дейін ақшаны қайтарып ала алады. Доктор Харриет Холл Science Based Medicine журналында жариялаған мақаласында Quincy компаниясының демеушілігімен жүргізілген зерттеудің («Мэдисон жад зерттеуі») нәтижесі теріс болғанын, бірақ компания оң нәтижелер табу үшін p-хакингті қолданғанын атап өтті. Ол олардың келтірген қауіпсіздік зерттеулері тек егеуқұйрықтарда жүргізілгенін және апоэкворинның қан-ми тосқаулын кесіп өтеді деген мәлімдемесі тек иттердегі зерттеуге негізделгенін жазды. Америка фармацевттер қауымдастығы «апоэкворин едәуір мөлшерде сіңірілмейтінін, керісінше аминқышқылдарына ыдырайтынын» ескертеді.
Apoaequorin is an ingredient in "Prevagen", which is marketed by Quincy Bioscience as a memory supplement. In 2017, the US Federal Trade Commission (FTC) charged the maker with falsely advertising that the product improves memory, provides cognitive benefits, and is "clinically shown" to work. According to the FTC, "the marketers of Prevagen preyed on the fears of older consumers experiencing age related memory loss". Quincy said that it would fight the charges. Prior to the suit, a clinical trial run by researchers employed by Quincy Bioscience "found no overall benefit compared to a placebo for its primary endpoints involving memory and cognition", while the company's advertising misleadingly cited a few contested subgroup analyses that showed slight improvements. The suit (Spath, et al. v. Quincy Bioscience Holding Company, Inc., et al., Case No. 18 cv 12416, D. NJ.) was dismissed in the District court, but an appeal seeking to overturn the dismissal was filed. The suit was consolidated with another against Quincy Pharmaceuticals, Vanderwerff v. Quincy Bioscience (Case No. 17 cv 784, D. NJ), which was the lead case. On February 21, 2019, the United States Court of Appeals for the Second Circuit ruled that the FTC and the state of New York could proceed with their lawsuit against Quincy Bioscience for its claims that Prevagen can improve memory. The order came less than two weeks after the parties argued the case before a three judge panel of the circuit, where company lawyers admitted they did not "dispute that if you look across the entire 211 people who completed the study there was no statistically significant difference". The court vigorously dismissed allegations by the company lawyers that the FTC pursued its action for political reasons. On March 23, 2020, a federal magistrate judge in the United States District Court for the Southern District of Florida entered a report and recommendations certifying a nationwide class action for the class of consumers who purchased Prevagen over the previous four years. The trial in the case was set for October 2020. Quincy Bioscience agreed to settle the claims that it misrepresented its Prevagen products as supporting brain health and helping with memory loss. Under the terms of the settlement, eligible purchasers applying by October 26, 2020 for purchases made from 2007 through July 31, 2020 could recover refunds of up to $70. Dr. Harriet Hall, writing for Science Based Medicine, noted that the Quincy sponsored study (known as "Madison Memory Study") was negative, but that the company utilized p hacking to find favorable results. She wrote that their cited safety studies were all rat studies and their claim that apoaequorin crosses the blood–brain barrier was based solely on a dog study. The American Pharmacists Association warns that Apoaequorin "is unlikely to be absorbed to a significant degree; instead it degrades into amino acids".