Акваорин: кальций-активированный фотопротеин из медузы Аурелии виктории.

Введение

Активированный кальцием фотопротеин

Аэкорин – это активированный кальцием фотопротеин, выделенный из гидрозои Aequorea victoria. Его биолюминесценция изучалась за десятилетия до того, как в 1962 году Осаму Шимомура изолировал этот белок из организма животного. В организме животного этот белок встречается вместе с зелёным флуоресцентным белком для производства зелёного света посредством резонансного переноса энергии, в то время как сам аэкорин генерирует синий свет. Дискуссии о "ДНК медузы", позволяющей создавать "светящихся" животных, часто касаются трансгенных животных, экспрессирующих зелёный флуоресцентный белок, а не аэкорин, хотя оба белка изначально происходят из одного и того же организма. Апоаэкорин, белковая составляющая аэкорина, входит в состав диетической добавки Prevagen. Федеральная торговая комиссия США (FTC) обвинила производителя в недобросовестной рекламе, связанной с заявлениями об улучшении памяти.

Открытие

Работа над экеорином началась с Э. Ньютона Харви в 1921 году. Хотя Харви не смог продемонстрировать классическую реакцию люциферазы с люциферином, он показал, что вода может вызывать свечение высушенных фотоцитов и что свечение может возникать даже в отсутствие кислорода. Позже, в 1961 году, Осаму Шимомура приступил к изучению биолюминесценции Aequorea. Это включало в себя кропотливый сбор десятков тысяч медуз с причалов в Фрайдей-Харбор, штат Вашингтон. Несмотря на то, что основной целью его работы была биолюминесценция, Шимомура и еще двое ученых, Мартин Чалфи и Роджер Цзиен, были удостоены Нобелевской премии в 2008 году за их исследования в области зеленых флуоресцентных белков.

Структура

Аэкорин – это голопротеин, состоящий из двух отдельных единиц: апопротеина, называемого апоаэкорином, с приблизительной молекулярной массой 21 кДа, и протезирующей группы – коэлентеразина, являющегося люциферином. Иными словами, апоаэкорин – это фермент, производимый в фотоцитах животного, а коэлентеразин – субстрат, окисление которого фермент катализирует. При связывании коэлентеразина образуется аэкорин. Важно отметить, что белок содержит три EF-hand мотива, функционирующие как центры связывания ионов Ca2+. Аэкорин принадлежит к суперсемейству кальцийсвязывающих белков, включающему около 66 подсемейств. Исследование кристаллической структуры показало, что аэкорин связывает коэлентеразин и кислород в форме перекиси – коэлентеразина 2 гидропероксида. Центр связывания первых двух атомов кальция проявляет в 20 раз большее сродство к кальцию, чем третий центр. Однако, более ранние утверждения о том, что только два EF-hand мотива связывают кальций, были поставлены под сомнение, поскольку последующие исследования структуры показали, что все три центра способны связывать кальций. Таким образом, титриметрические исследования демонстрируют, что все три центра связывания кальция активны, но для запуска ферментативной реакции достаточно двух ионов. Другие исследования выявили наличие внутренней дисульфидной связи, поддерживающей структуру аэкорина. Это также объясняет необходимость использования тиольного реагента, такого как бета-меркаптоэтанол, для регенерации белка, поскольку такие реагенты ослабляют сульфгидрильные связи между остатками цистеина, ускоряя регенерацию аэкорина. Химическая характеристика аэкорина указывает на относительную устойчивость белка к жестким условиям обработки. Аэкорин термостабилен. При нагревании до 95 °C в течение 2 минут белок теряет лишь 25% активности. Денатурирующие агенты, такие как 6 М мочевина или 4 М гидрохлорид гуанидина, не разрушают белок.

Генетика

Экваорин, вероятно, закодирован в геноме Aequorea. По крайней мере, четыре копии гена были выделены в виде кДНК из этого животного. Поскольку геном не секвенирован, неясно, могут ли варианты кДНК объяснить все изоформы белка.

Механизм действия

Ранние исследования биолюминесценции Aequorea, проведенные Э. Ньютоном Харви, показали, что биолюминесценция проявляется в виде кольца вокруг колокола и происходит даже при отсутствии воздуха. Это было примечательно, поскольку большинство биолюминесцентных реакций требуют кислорода, что привело к предположению о том, что животные каким-то образом запасают кислород. Позже было установлено, что апопротеин способен стабильно связывать коэлентеразин 2 гидропероксид, а кислород необходим для регенерации аэкуорина в эту активную форму. Однако в присутствии ионов кальция белок претерпевает конформационное изменение и преобразует свою протетическую группу, коэлентеразин 2 гидропероксид, в возбужденный коэлентерамид и CO2. При переходе возбужденного коэлентерамида в основное состояние излучается синий свет (длина волны 465 нм). До того, как коэлентерамид замещается, весь белок остается флуоресцирующим, голубого цвета. Благодаря связи между биолюминесценцией и флуоресценцией, это свойство сыграло важную роль в открытии люциферина – коэлентеразина.

Приложения

Поскольку излучаемый свет может быть легко обнаружен с помощью люминометра, аэкорин стал полезным инструментом в молекулярной биологии для измерения внутриклеточных уровней Ca2+. Ранняя успешная очистка аэкорина привела к первым экспериментам, включавшим введение белка в ткани живых животных для визуализации физиологического высвобождения кальция в мышечных волокнах рака-моллюска. С тех пор белок широко используется во многих модельных биологических системах, включая данио-рерио, крыс, мышей и культивируемые клетки. Культивируемые клетки, экспрессирующие ген аэкорина, могут эффективно синтезировать апоаэкорин; однако, рекомбинантная экспрессия дает только апопротеин. Поэтому необходимо добавлять коэлентеразин в среду культивирования клеток для получения функционального белка и, следовательно, использовать его синее свечение для измерения концентрации Ca2+. Коэлентеразин – гидрофобная молекула, и поэтому легко проникает через клеточные стенки растений и грибов, а также плазматическую мембрану высших эукариот, что делает аэкорин подходящим в качестве репортера Ca2+ в растениях, грибах и клетках млекопитающих. Аэкорин обладает рядом преимуществ по сравнению с другими индикаторами Ca2+. Благодаря большому размеру белка, его утечка из клеток ниже, чем у липофильных красителей, таких как DiI. Он не проявляет явлений внутриклеточной компартментализации или секвестрации, часто наблюдаемых у красителей, чувствительных к напряжению, и не нарушает функции клеток или развитие эмбриона. Кроме того, свет, излучаемый при окислении коэлентеразина, не зависит от оптического возбуждения, что устраняет проблемы с автофлуоресценцией. Основным ограничением аэкорина является необратимое потребление протезной группы коэлентеразина при генерации света, что требует его непрерывного добавления в среду. Эти проблемы привели к разработке других генетически закодированных датчиков кальция, включая датчик камелеон на основе кальмодулина, разработанный Роджером Цьеном, и датчик на основе тропонина TN XXL, разработанный Оливером Гризбеком.

Since the emitted light can be easily detected with a luminometer, aequorin has become a useful tool in molecular biology for the measurement of intracellular Ca2+ levels. The early successful purification of aequorin led to the first experiments involving the injection of the protein into the tissues of living animals to visualize the physiological release of calcium in the muscle fibers of a barnacle. Since then, the protein has been widely used in many model biological systems, including zebrafish, rats, mice, and cultured cells. Cultured cells expressing the aequorin gene can effectively synthesize apoaequorin; however, recombinant expression yields only the apoprotein. Therefore it is necessary to add coelenterazine into the culture medium of the cells to obtain a functional protein and thus use its blue light emission to measure Ca2+ concentration. Coelenterazine is a hydrophobic molecule, and therefore is easily taken up across plant and fungal cell walls, as well as the plasma membrane of higher eukaryotes, making aequorin suitable as a Ca2+ reporter in plants, fungi, and mammalian cells. Aequorin has a number of advantages over other Ca2+ indicators. Because the protein is large, it has a low leakage rate from cells compared to lipophilic dyes such as DiI. It lacks phenomena of intracellular compartmentalization or sequestration as is often seen for Voltage sensitive dyes, and does not disrupt cell functions or embryo development. Moreover, the light emitted by the oxidation of coelenterazine does not depend on any optical excitation, so problems with auto fluorescence are eliminated. The primary limitation of aequorin is that the prosthetic group coelenterazine is irreversibly consumed to produce light, and requires continuous addition of coelenterazine into the media. Such issues led to developments of other genetically encoded calcium sensors including the calmodulin based sensor cameleon, developed by Roger Tsien and the troponin based sensor, TN XXL, developed by Oliver Griesbeck.

Маркетинг и юридические проблемы

Апоаэкуорин является ингредиентом препарата "Преваген", который компания Quincy Bioscience продает как средство для улучшения памяти. В 2017 году Федеральная торговая комиссия США (FTC) обвинила производителя в ложной рекламе, утверждая, что продукт улучшает память, обеспечивает когнитивные преимущества и "клинически доказано" эффективен. По данным FTC, "маркетологи "Превагена" спекулировали на страхах пожилых потребителей, страдающих от возрастного ухудшения памяти". Компания Quincy заявила, что будет оспаривать обвинения. До подачи иска клиническое исследование, проведенное исследователями, работавшими в Quincy Bioscience, "не выявило общей пользы по сравнению с плацебо по основным показателям, касающимся памяти и когнитивных функций", в то время как реклама компании вводяще ссылалась на несколько спорных анализов подгрупп, показавших незначительные улучшения. Иск (Spath, et al. v. Quincy Bioscience Holding Company, Inc., et al., дело № 18 cv 12416, D. Нью-Джерси) был отклонен в окружном суде, но была подана апелляция с целью отмены этого решения. Иск был объединен с другим иском против Quincy Pharmaceuticals, Vanderwerff v. Quincy Bioscience (дело № 17 cv 784, D. Нью-Джерси), который являлся основным делом. 21 февраля 2019 года Апелляционный суд США по второму округу постановил, что FTC и штат Нью-Йорк могут продолжить судебное разбирательство против Quincy Bioscience в связи с заявлениями о том, что "Преваген" способен улучшать память. Постановление было вынесено менее чем через две недели после того, как стороны представили свои аргументы перед коллегией из трех судей, где адвокаты компании признали, что не "оспаривают тот факт, что при анализе данных всех 211 участников исследования статистически значимой разницы не наблюдалось". Суд решительно отверг утверждения адвокатов компании о том, что FTC преследовала политические мотивы. 23 марта 2020 года федеральный магистратский судья в Окружном суде США по Южному округу Флориды подготовил заключение и рекомендации о признании общенационального коллективного иска в отношении потребителей, приобретших "Преваген" за предыдущие четыре года. Судебное разбирательство было назначено на октябрь 2020 года. Quincy Bioscience согласилась урегулировать претензии, связанные с искажением информации о своих продуктах "Преваген" как поддерживающих здоровье мозга и помогающих при потере памяти. В соответствии с условиями соглашения, покупатели, имеющие право на возмещение и подавшие заявку до 26 октября 2020 года за покупки, совершенные в период с 2007 по 31 июля 2020 года, могли получить возмещение в размере до 70 долларов США. Доктор Харриет Холл, пишущая для Science Based Medicine, отметила, что исследование, спонсируемое Quincy (известное как "Исследование памяти Мэдисона"), дало отрицательные результаты, но компания использовала "p-hacking" для получения благоприятных результатов. Она также отметила, что все исследования безопасности, на которые ссылалась компания, были проведены на крысах, а утверждение о том, что апоаэкуорин преодолевает гематоэнцефалический барьер, основано исключительно на исследовании на собаках. Американская фармацевтическая ассоциация предупреждает, что апоаэкуорин "вряд ли будет в значительной степени усваиваться; вместо этого он расщепляется на аминокислоты".

Apoaequorin is an ingredient in "Prevagen", which is marketed by Quincy Bioscience as a memory supplement. In 2017, the US Federal Trade Commission (FTC) charged the maker with falsely advertising that the product improves memory, provides cognitive benefits, and is "clinically shown" to work. According to the FTC, "the marketers of Prevagen preyed on the fears of older consumers experiencing age related memory loss". Quincy said that it would fight the charges. Prior to the suit, a clinical trial run by researchers employed by Quincy Bioscience "found no overall benefit compared to a placebo for its primary endpoints involving memory and cognition", while the company's advertising misleadingly cited a few contested subgroup analyses that showed slight improvements. The suit (Spath, et al. v. Quincy Bioscience Holding Company, Inc., et al., Case No. 18 cv 12416, D. NJ.) was dismissed in the District court, but an appeal seeking to overturn the dismissal was filed. The suit was consolidated with another against Quincy Pharmaceuticals, Vanderwerff v. Quincy Bioscience (Case No. 17 cv 784, D. NJ), which was the lead case. On February 21, 2019, the United States Court of Appeals for the Second Circuit ruled that the FTC and the state of New York could proceed with their lawsuit against Quincy Bioscience for its claims that Prevagen can improve memory. The order came less than two weeks after the parties argued the case before a three judge panel of the circuit, where company lawyers admitted they did not "dispute that if you look across the entire 211 people who completed the study there was no statistically significant difference". The court vigorously dismissed allegations by the company lawyers that the FTC pursued its action for political reasons. On March 23, 2020, a federal magistrate judge in the United States District Court for the Southern District of Florida entered a report and recommendations certifying a nationwide class action for the class of consumers who purchased Prevagen over the previous four years. The trial in the case was set for October 2020. Quincy Bioscience agreed to settle the claims that it misrepresented its Prevagen products as supporting brain health and helping with memory loss. Under the terms of the settlement, eligible purchasers applying by October 26, 2020 for purchases made from 2007 through July 31, 2020 could recover refunds of up to $70. Dr. Harriet Hall, writing for Science Based Medicine, noted that the Quincy sponsored study (known as "Madison Memory Study") was negative, but that the company utilized p hacking to find favorable results. She wrote that their cited safety studies were all rat studies and their claim that apoaequorin crosses the blood–brain barrier was based solely on a dog study. The American Pharmacists Association warns that Apoaequorin "is unlikely to be absorbed to a significant degree; instead it degrades into amino acids".