Жсандық плазмида pBR322 және оның клондау вектор ретіндегі маңызы
PBR322
Жсанды плазмида pBR322 – E. coli-дегі клондауға арналған алғашқы векторлардың бірі. AmpR, TetR гендері, репликация және көшірме санын реттеуге қатысты ақпарат.
Ағылшыншамен салыстырыңыз: абзацты басыңыз — түпнұсқа терезеде ашылады. Абзац астындағы EN түймесі оны мәтін ішінде көрсетеді.
Кіріспе
Жасанды плазмид
Artificial plasmid
pBR322 – плазмид және алғашқы кеңінен қолданылған *E. coli* клондау векторларының бірі. 1977 жылы Калифорния университетінің Сан-Франциско қаласындағы Герберт Бойер зертханасында жасалған, ол докторлық зерттеуші Франсиско Боливар Запата және Реймонд Л. Родригестің есімімен аталған. "p" әрпі "плазмидті", ал "BR" – "Боливар" және "Родригес" дегенді білдіреді. pBR322-нің ұзындығы 4361 негіз жұбын құрайды және екі антибиотикке төзімділік гендері бар: *bla* гені ампициллинге төзімділік (AmpR) ақуызын, ал *tetA* гені тетрациклинге төзімділік (TetR) ақуызын кодтайды. Ол *pMB1*-дің репликация басталу нүктесін және плазмид көшірмелерінің санын шектейтін *rop* генін қамтиды. Плазмидте қырықтан астам рестрикциялық ферменттерге арналған бірегей рестрикциялық орындар бар. Осы қырық орынның он бірі *TetR* генінің ішінде орналасқан. *TetR* генінің промоторында *HindIII* және *ClaI* рестрикциялық ферменттері үшін екі орын бар. *AmpR* генінде алты маңызды рестрикциялық орын бар. Бұл антибиотикке төзімділік гендері тетрациклин үшін *pSC101*-ден, ал ампициллин үшін *RSF2124*-тен алынған. Дөңгелек тізбек нөмірленген, мұнда 0 – бірегей *EcoRI* орынының ортасы, ал сан *TetR* гені арқылы өседі. Мысалы, егер ампициллинді жою қажет болса, *PstI* ферментіне қарсы рестрикциялық эндонуклеазаны немесе молекулалық қайшыны қолдану керек, сонда pBR322 ампициллинге сезімтал болады. Сол сияқты, инсерциялық инактивация процесін тетрациклинге де қолдануға болады. *AmpR* гені пенициллин бета-лактамазасы болып табылады. *P1* және *P3* промоторлары бета-лактамаза гені үшін жұмыс істейді. *P3* – табиғи промотор, ал *P1* – екі түрлі ДНК фрагментін байланыстыру арқылы pBR322 жасау үшін жасанды түрде құрылған. *P2* промоторы *P1* сияқты бір аймақта орналасқан, бірақ қарама-қарсы тарамда орналасып, тетрациклинге төзімділік генінің бағытында транскрипцияны бастайды.
pBR322 is a plasmid and was one of the first widely used E. coli cloning vectors. Created in 1977 in the laboratory of Herbert Boyer at the University of California, San Francisco, it was named after Francisco Bolivar Zapata, the postdoctoral researcher and Raymond L. Rodriguez. The p stands for "plasmid," and BR for "Bolivar" and "Rodriguez." pBR322 is 4361 base pairs in length and has two antibiotic resistance genes – the gene bla encoding the ampicillin resistance (AmpR) protein, and the gene tetA encoding the tetracycline resistance (TetR) protein. It contains the origin of replication of pMB1, and the rop gene, which encodes a restrictor of plasmid copy number. The plasmid has unique restriction sites for more than forty restriction enzymes. Eleven of these forty sites lie within the TetR gene. There are two sites for restriction enzymes HindIII and ClaI within the promoter of the TetR gene. There are six key restriction sites inside the AmpR gene. The source of these antibiotic resistance genes are from pSC101 for Tetracycline and RSF2124 for Ampicillin. The circular sequence is numbered such that 0 is the middle of the unique EcoRI site and the count increases through the TetR gene. If we have to remove ampicillin for instance, we must use restriction endonuclease or molecular scissors against PstI and then pBR322 will become anti resistant to ampicillin. The same process of Insertional Inactivation can be applied to Tetracycline. The AmpR gene is penicillin beta lactamase. Promoters P1 and P3 are for the beta lactamase gene. P3 is the natural promoter, and P1 is artificially created by the ligation of two different DNA fragments to create pBR322. P2 is in the same region as P1, but it is on the opposite strand and initiates transcription in the direction of the tetracycline resistance gene.
Өмірбаян
Алғашқы клондау эксперименттері ColE1 және pSC101 сияқты табиғи плазмидтерді пайдалана отырып жүргізілуі мүмкін. Бұл плазмидтердің әрқайсысының артықшылықтары мен кемшіліктері болуы мүмкін. Мысалы, ColE1 плазмиді және оның туындылары жоғары көшірме санының артықшылығына ие және плазмидтің хлорамфениколмен күшейте отырып, плазмидтің жоғары өнімділігін алуға мүмкіндік береді, алайда E1 колицине қарсы иммунитетті анықтау техникалық жағынан қиын. pSC101 тетрациклинге төзімділік береді, бұл антибиотиктерді таңдау арқылы қарапайым скрининг процесін жүргізуге мүмкіндік береді, бірақ бұл плазмидтің көшірме саны аз, ол плазмидтің жоғары өнімділігін бермейді. ColE1 туындысы болып табылатын RSF 2124 деген басқа плазмид ампициллинге төзімділік береді, бірақ одан үлкен. Клондау үшін қолайлы плазмид жасау мақсатымен көптеген басқа плазмидтер жасанды түрде құрастырылды, ал pBR322 көптеген ғалымдар үшін ең әмбебап болып танылды, сондықтан ол ең көп қолданылатын плазмид болды. Оның екі антибиотиктерге төзімді гендері бар, оларды таңдау маркерлері ретінде пайдалануға болады, сондай-ақ оны клондау векторы ретінде қолдануға қолайлы ететін бірнеше ыңғайлы және бірегей шектеу ферменттерінің орындары бар. Плазмид 3 негізгі көзден алынған генетикалық материалмен құрастырылды: pSC101 тетрациклинге төзімділік гені, RSF2124 ампициллинге төзімділік гені және ColE1 плазмидінің жақын туысы pMB1 репликациялық элементтері. Содан бері pBR322 негізіндегі көптеген басқа плазмидтер әр түрлі мақсаттар үшін арнайы құрастырылды. Мысалы, pUC сериялы плазмидтерін атауға болады. Көптеген экстрахромосомалық белок экспрессиясы және шаттл векторлары репликацияның pBR322 бастау тегін қамтиды, ал pBR322 фрагменттері хромосомадан ДНК-ның мақсатты интеграциясы мен экзициясы үшін түр ішіндегі шаттл немесе бинарлық векторлар және векторларды құрастыруда кеңінен қолданылады.
Early cloning experiments may be conducted using natural plasmids such the ColE1 and pSC101. Each of these plasmids may have its advantages and disadvantages. For example, the ColE1 plasmid and its derivatives have the advantage of higher copy number and allow for chloramphenicol amplification of plasmid to produce a high yield of plasmid, however screening for immunity to colicin E1 is not technically simple. confers tetracycline resistance which allows for simpler screening process with antibiotic selection, but it is a low copy number plasmid which does not give a high yield of plasmid. Another plasmid, RSF 2124, which is a derivative of ColE1, confers ampicillin resistance but is larger. Many other plasmids were artificially constructed to create one that would be ideal for cloning purpose, and pBR322 was found to be most versatile by many and was therefore the one most popularly used. It has two antibiotic resistance genes, as selectable markers, and a number of convenient unique restriction sites that made it suitable as a cloning vector. The plasmid was constructed with genetic material from 3 main sources – the tetracycline resistance gene of pSC101, the ampicillin resistance gene of RSF 2124, and the replication elements of pMB1, a close relative of the ColE1 plasmid. A large number of other plasmids based on pBR322 have since been constructed specifically designed for a wide variety of purposes. Examples include the pUC series of plasmids. Most expression vectors for extrachromosomal protein expression and shuttle vectors contain the pBR322 origin of replication, and fragments of pBR322 are very popular in the construction of intraspecies shuttle or binary vectors and vectors for targeted integration and excision of DNA from chromosome.