Молекулалық биологиядағы нақты уақыт ПТР және кері транскрипция ПТР техникасы

Реал-уақыт ПТР (qPCR) – ДНК молекуласын күшейтуді бақылайтын молекулалық биология әдісі. Қаншалықты ДНК бар екенін анықтауға көмектеседі. RT-qPCR туралы біліңіз!

12 мин оқу

100%

Дереккөз: Real-time polymerase chain reaction — Wikipedia

Ағылшыншамен салыстырыңыз: абзацты басыңыз — түпнұсқа терезеде ашылады. Абзац астындағы EN түймесі оны мәтін ішінде көрсетеді.

Мазмұны

Кіріспе

Молекулалық биологияның зертханалық әдісі кері транскрипциялы полимераза тізбекті реакция (RT PCR)

Нақты уақыт полимераза тізбекті реакция (нақты уақыт ПТР немесе сандық қолданылғанда qPCR) – полимераза тізбекті реакцияға (ПТР) негізделген молекулалық биологияның зертханалық әдісі. Ол мақсатты ДНК молекуласының амплификациясын, дәстүрлі ПТР-дегідей, оның соңында емес, ПТР барысында (яғни, нақты уақытта) бақылайды. Нақты уақыт ПТР сандық және жартылай сандық (яғни, ДНК молекулаларының белгілі бір мөлшерінен жоғары/төмен) түрде қолданылуы мүмкін. ПТР өнімдерін нақты уақыт режимінде анықтаудың екі кең таралған әдісі: 1) кез келген екі тізбекті ДНК-мен байланысатын ерекше емес флуоресцентті бояулар және 2) флуоресцентті белгімен таңбаланған олигонуклеотидтерден тұратын тізбекті ДНК-ның арнайы зондтары, бұл зондты оның толыққанды тізбегімен гибридтеуден кейін ғана анықтауға мүмкіндік береді. Сапалы нақты уақыт ПТР эксперименттерін жариялау үшін қажетті минималды ақпарат (MIQE) ережелері qPCR аббревиатурасын сандық нақты уақыт ПТР үшін, ал RT qPCR – кері транскрипциялы qPCR үшін пайдалануды ұсынады. "RT PCR" аббревиатурасы көбінесе кері транскрипциялы полимераза тізбекті реакцияны білдіреді, бірақ нақты уақыт ПТР-ді емес, алайда барлық авторлар осы конвенцияны сақтамайды.

Өмірбаян

Барлық организмдердегі жасушалар ген транскриптерінің айналымы арқылы ген экспрессиясын реттейді (бір тізбекті РНК): Жасушадағы экспрессияланған геннің мөлшерін үлгідегі осы геннің РНК транскриптісінің көшірмелерінің санымен өлшеуге болады. Аз мөлшердегі РНК-дан ген экспрессиясын сенімді анықтау және өлшеу үшін ген транскриптісін күшейту қажет. Полимераза тізбектік реакциясы (ПТР) ДНК-ны күшейтуге арналған әдіс; РНК-ға негізделген ПТР үшін РНК үлгісі алдымен кері транскрипция арқылы комплементарлы ДНК-ға (кДНК) айналдырылады. ДНК-ның шағын мөлшерін күшейту үшін дәстүрлі ПТР әдісі қолданылады, онда ДНК үлгісі, кем дегенде бір жұп арнайы праймерлер, дезоксирибонуклеотид трифосфаттары, қолайлы буферлік ерітінді және термостабильді ДНК полимераза қолданылады. Флюороформен белгіленген зат осы қоспаға жылу циклінде қосылады, онда флюорофордың флуоресценциясын өлшеуге арналған сенсорлар бар, оны қажетті толқын ұзындығында қоздыру арқылы бір немесе бірнеше нақты өнімдердің пайда болу жылдамдығын өлшеуге мүмкіндік береді. Бұл әрбір ПТР циклында күшейтілген өнімнің пайда болу жылдамдығын өлшеуге мүмкіндік береді. Осылайша алынған деректер компьютерлік бағдарламалық қамтамасыз ету арқылы бірнеше үлгідегі салыстырмалы ген экспрессиясын (немесе мРНК көшірме санын) есептеу үшін талдауға жарамды. Санық ПТР ДНК-ны анықтау және өлшеу үшін де қолданылады, бұл үлгілердегі белгілі бір ДНК тізбегінің болуын және мөлшерін анықтауға мүмкіндік береді. Бұл өлшеу әрбір күшейту циклынан кейін жасалады, сондықтан бұл әдіс нақты уақыт ПТР (яғни бірден немесе бір мезгілдегі ПТР) деп аталады. Санық ПТР және ДНК микромассивтері ген экспрессиясын зерттеудің қазіргі заманғы әдістері болып табылады. МРНК мөлшерін өлшеу үшін бұрынғы әдістер қолданылды: дифференциалды дисплей, RNase қорғау әсері және солтүстік блот. Солтүстік блот көбінесе геннің экспрессия деңгейін бағау үшін қолданылады, оның мРНК транскриптісінің үлгідегі мөлшерін көрсетеді. Бұл әдісте тазартылған РНК агароза гельдік электрофорез арқылы бөлінеді, қатты матрицаға (мысалы, нейлон мембранаға) беріледі және зерттелетін генге толық сәйкес келетін ДНК немесе РНК зондымен зерттеледі. Бұл әдіс әлі де ген экспрессиясын бағау үшін қолданылса да, ол салыстырмалы түрде көп РНК талап етеді және мРНК деңгейі туралы тек сапалық немесе жартылай сандық ақпарат береді. Сандық әдістің өзгеруінен туындаған қателер ДНК тұтастығы, фермент тиімділігі және басқа да көптеген факторлардың нәтижесі болуы мүмкін. Осы себепті стандарттау жүйелері (көбінесе нормалдау әдістері деп аталады) әзірленді. Кейбірлері жалпы ген экспрессиясын өлшеу үшін әзірленді, бірақ көбінесе зерттелетін генді тұрақты экспрессия деңгейі бар басқа генге қатысты өлшеуге бағытталған, ол нормалдаушы ген деп аталады. Бұл гендер көбінесе үй шаруашылығы гендерінен таңдалады, өйткені олардың жасушаның негізгі тіршілік етуімен байланысты функциялары әдетте конститутивті ген экспрессиясын білдіреді. Бұл зерттеушілерге қызығушылық тудыратын гендердің экспрессиясының нормалдаушы геннің экспрессиясына қатынасын хабарлауға мүмкіндік береді, осылайша оның абсолютті экспрессия деңгейін білмей, бұрынғысын салыстыруға мүмкіндік береді. Ең көп қолданылатын нормалдаушы гендер келесі молекулаларды кодтайтын гендер: тубулин, глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназа, альбумин, циклофилин және рибосомалық РНК. Үшінші, 68-72 °C аралығындағы температура ДНК полимеразамен жүзеге асырылатын полимерлендіруді жеңілдетеді. Фрагменттердің кішігірім болуына байланысты соңғы қадам осы типтегі ПТР-да көбінесе алынып тасталады, өйткені фермент сәйкестендіру және денатурация кезеңдері арасындағы ауысу кезінде ДНК ампликонын көбейтуге қабілетті. Сонымен қатар, төрт кезеңді ПТР-да флуоресценция әрбір циклде бірнеше секундқа созылатын қысқа температуралық фазаларда, мысалы 80 °C температурада өлшенеді, бұл арнайы емес бояғыш қолданылған жағдайда праймер димерлерінің пайда болуынан туындаған сигналды азайтуға мүмкіндік береді. Әрбір цикл үшін қолданылатын температуралар мен уақыттар фермент, реакциядағы дивалентті иондар мен дезоксирибонуклеотид трифосфаттарының (dNTP) концентрациясы және праймерлердің байланыс температурасы сияқты көптеген факторларға байланысты.

Cells in all organisms regulate gene expression by turnover of gene transcripts (single stranded RNA): The amount of an expressed gene in a cell can be measured by the number of copies of an RNA transcript of that gene present in a sample. In order to robustly detect and quantify gene expression from small amounts of RNA, amplification of the gene transcript is necessary. The polymerase chain reaction (PCR) is a common method for amplifying DNA; for RNA based PCR the RNA sample is first reverse transcribed to complementary DNA (cDNA) with reverse transcriptase. In order to amplify small amounts of DNA, the same methodology is used as in conventional PCR using a DNA template, at least one pair of specific primers, deoxyribonucleotide triphosphates, a suitable buffer solution and a thermo stable DNA polymerase. A substance marked with a fluorophore is added to this mixture in a thermal cycler that contains sensors for measuring the fluorescence of the fluorophore after it has been excited at the required wavelength allowing the generation rate to be measured for one or more specific products. This allows the rate of generation of the amplified product to be measured at each PCR cycle. The data thus generated can be analysed by computer software to calculate relative gene expression (or mRNA copy number) in several samples. Quantitative PCR can also be applied to the detection and quantification of DNA in samples to determine the presence and abundance of a particular DNA sequence in these samples. This measurement is made after each amplification cycle, and this is the reason why this method is called real time PCR (that is, immediate or simultaneous PCR). Quantitative PCR and DNA microarray are modern methodologies for studying gene expression. Older methods were used to measure mRNA abundance: differential display, RNase protection assay and northern blot. Northern blotting is often used to estimate the expression level of a gene by visualizing the abundance of its mRNA transcript in a sample. In this method, purified RNA is separated by agarose gel electrophoresis, transferred to a solid matrix (such as a nylon membrane), and probed with a specific DNA or RNA probe that is complementary to the gene of interest. Although this technique is still used to assess gene expression, it requires relatively large amounts of RNA and provides only qualitative or semi quantitative information of mRNA levels. Estimation errors arising from variations in the quantification method can be the result of DNA integrity, enzyme efficiency and many other factors. For this reason a number of standardization systems (often called normalization methods) have been developed. Some have been developed for quantifying total gene expression, but the most common are aimed at quantifying the specific gene being studied in relation to another gene called a normalizing gene, which is selected for its almost constant level of expression. These genes are often selected from housekeeping genes as their functions related to basic cellular survival normally imply constitutive gene expression. This enables researchers to report a ratio for the expression of the genes of interest divided by the expression of the selected normalizer, thereby allowing comparison of the former without actually knowing its absolute level of expression. The most commonly used normalizing genes are those that code for the following molecules: tubulin, glyceraldehyde 3 phosphate dehydrogenase, albumin, cyclophilin, and ribosomal RNAs. the third, at between 68 and 72 °C, facilitates the polymerization carried out by the DNA polymerase. Due to the small size of the fragments the last step is usually omitted in this type of PCR as the enzyme is able to replicate the DNA amplicon during the change between the alignment stage and the denaturing stage. In addition, in four step PCR the fluorescence is measured during short temperature phases lasting only a few seconds in each cycle, with a temperature of, for example, 80 °C, in order to reduce the signal caused by the presence of primer dimers when a non specific dye is used. The temperatures and the timings used for each cycle depend on a wide variety of parameters, such as: the enzyme used to synthesize the DNA, the concentration of divalent ions and deoxyribonucleotide triphosphates (dNTPs) in the reaction and the bonding temperature of the primers.

Химиялық сыныптама

Нақты уақыт ПТР техникасы ПТР өнімін анықтау үшін қолданылатын химиялық реагенттерге, нақты немесе нақты емес флуоресценттік бояғыштарға сәйкес жіктелуі мүмкін.

Белгісіз анықтау: репортер ретінде екі тізбекті ДНК-ны байлайтын бояғыштарды қолдана отырып, нақты уақыт режимімен жүргізілетін ПТР

ДНҚ-мен байланысатын бояу ПТР-де барлық екі жіпті (ds) ДНҚ-мен байланысады, бояудың флуоресценциялық кванттық шығымын арттырады. Сондықтан, ПТР кезінде ДНК өнімінің көбеюі, әр циклда өлшенетін флуоресценция интенсивтілігінің артуына алып келеді. Дегенмен, SYBR Green сияқты екі жіпті ДНҚ бояғыштары барлық екі жіпті ДНҚ ПТР өнімдеріне, соның ішінде нақты емес ПТР өнімдеріне (мысалы, праймер димеріне) байланысады. Бұл, қажетті таңбалық тізбектің дұрыс бақылануына бөгет жасай алады немесе оны тоқтатуы мүмкін. Екі жіпті ДНҚ бояғыштарымен нақты уақыт ПТР-де реакция әдеттегідей дайындалады, флуоресцентті екі жіпті ДНҚ бояғышы қосылады. Содан кейін реакция нақты уақыт ПТР құралында жүргізіледі, және әр циклдан кейін флуоресценция интенсивтілігі детектормен өлшенеді; бояғыш тек екі жіпті ДНҚ-ға (яғни ПТР өніміне) байланысқанда ғана флуоресценция жасайды. Бұл әдістің артықшылығы – күшейтуді жүзеге асыру үшін тек бір жұп праймер қажет, бұл шығындарды төмендетеді; әр түрлі бояуларды қолдану арқылы бір түтікшеде бірнеше таңбалық тізбектерді бақылауға болады.

Анықтау: флуоресцентті репортерлік зонд әдісі

Флуоресцентті репортерлік зондтар тек зондқа толықтыратын тізбекті қамтитын ДНК-ны ғана анықтайды; сондықтан репортерлік зондты қолдану ерекшелікті айтарлықтай арттырады және басқа екі тізбекті ДНК-ның (dsDNA) қатысуында да техниканы орындауға мүмкіндік береді. Флуоресцентті зондтарды әртүрлі түсті таңбаларды пайдалану арқылы бір сынауда бірнеше нысаналық тізбектерді бақылау үшін мультиплексті талдауларда қолдануға болады. Флуоресцентті репортерлік зондтардың ерекшелігі сонымен қатар ПТР-дағы немесе полимераздық тізбекті көбейту реакциясындағы (ПТР) праймер димерлерінен туындаған өлшемдерге кедергі келтірмейді, себебі праймер димерлері – бұл ПТР-дың қажетсіз қосалқы өнімдері. Дегенмен, флуоресцентті репортерлік зондтар праймер димерлерінің тежеуші әсерін тоқтатпайды, бұл реакциядағы қажетті өнімдердің жиналуын баяулатуы мүмкін. Бұл әдіс ДНК-ға негізделген зондты пайдаланады, оның бір жағында флуоресцентті репортер, ал қарсы жағында флуоресценцияны жойғыш (сөндіргіш) болады. Репортер мен жойғыштың өте жақын орналасуы оның флуоресценциясын анықтауға кедеріс келтіреді; зондтың Taq полимеразасының 5'-3' экзонуклеазалық активтілігімен ыдырауы репортер мен жойғыштың жақындығын бұзады, соның салдарынан флуоресценцияның сөнбеген шығарылуына мүмкіндік береді, оны лазермен қоздырудан кейін анықтауға болады. Сондықтан, әрбір ПТР циклында репортерлік зондтың нысаналық өнімінің артуы зондтың ыдырауына және репортердің босатылуына байланысты флуоресценцияның пропорционалды артуына әкеледі. ПТР әдеттегідей дайындалады (ПТР қараңыз), және репортерлік зонд қосылады. Реакция басталғанда, ПТР-дың оттегілу кезеңінде зонд және праймерлер екеуі де ДНК нысанасына оттегіледі. Жаңа ДНК тізбегінің полимерленуі праймерлерден басталады, ал полимераза зондқа жеткенде, оның 5'-3' экзонуклеазасы зондты ыдыратады, флуоресцентті репортерді жойғыштан физикалық түрде бөліп, флуоресценцияның артуына себеп болады. Флуоресценция нақты уақыт ПТР машинасымен анықталады және өлшенеді, ал оның геометриялық өсуі өнімнің экспоненциалды өсуіне сәйкес келеді, бұл әрбір реакциядағы сандық циклды (Cq) анықтау үшін қолданылады.

Fluorescent reporter probes detect only the DNA containing the sequence complementary to the probe; therefore, use of the reporter probe significantly increases specificity, and enables performing the technique even in the presence of other dsDNA. Using different coloured labels, fluorescent probes can be used in multiplex assays for monitoring several target sequences in the same tube. The specificity of fluorescent reporter probes also prevents interference of measurements caused by primer dimers, which are undesirable potential by products in PCR. However, fluorescent reporter probes do not prevent the inhibitory effect of the primer dimers, which may depress accumulation of the desired products in the reaction. The method relies on a DNA based probe with a fluorescent reporter at one end and a quencher of fluorescence at the opposite end of the probe. The close proximity of the reporter to the quencher prevents detection of its fluorescence; breakdown of the probe by the 5' to 3' exonuclease activity of the Taq polymerase breaks the reporter quencher proximity and thus allows unquenched emission of fluorescence, which can be detected after excitation with a laser. An increase in the product targeted by the reporter probe at each PCR cycle therefore causes a proportional increase in fluorescence due to the breakdown of the probe and release of the reporter. The PCR is prepared as usual (see PCR), and the reporter probe is added. As the reaction commences, during the annealing stage of the PCR both probe and primers anneal to the DNA target. Polymerisation of a new DNA strand is initiated from the primers, and once the polymerase reaches the probe, its 5' 3' exonuclease degrades the probe, physically separating the fluorescent reporter from the quencher, resulting in an increase in fluorescence. Fluorescence is detected and measured in a real time PCR machine, and its geometric increase corresponding to exponential increase of the product is used to determine the quantification cycle (Cq) in each reaction.

Отырау температурасын талдау

Нақты уақыт ПТР, олардың балқу температурасын (сонымен қатар Tm мәні, яғни балқу температурасынан алынған) талдау арқылы нақты, күшейтілген ДНК фрагменттерін анықтауға мүмкіндік береді. Әдетте, екі тізбекті ДНК-ға байланысатын бояғыштарды репортер ретінде пайдаланатын ПТР әдісі қолданылады, ал қолданылатын бояу көбінесе SYBR Green болып табылады. ДНК-ның балқу температурасы күшейтілген фрагментке тән. Бұл техниканың нәтижелері талданатын ДНК үлгілерінің диссоциация қисықтарын салыстыру арқылы алынады. Дәстүрлі ПТР-ден айырмашылығы, бұл әдіс барлық үлгілердің нәтижелерін көрсету үшін электрофорездік техникаларды қолдану қажеттілігін жояды. Бұл, техника кинетикалық болғанына қарамастан, сандық ПТР көбінесе нақты соңғы нүктеде бағаланады. Сондықтан, бұл техника көбінесе электрофорезге қарағанда жылдам нәтижелер береді және/немесе аз мөлшерде реактивтерді қолданады. Егер қосымша электрофорез қажет болса, тек нақты уақыт ПТР күмәнді деп көрсеткен үлгілерді ғана тексеру қажет, сондай-ақ белгілі бір анықтамаға оң нәтиже берген үлгілердің нәтижелерін растау қажет.

Модельдеу

Соңғы нүктедегі ПТР-дан (конвенциялық ПТР-дан) айырмашылығы, нақты уақыт ПТР флуоресценцияны өлшеу арқылы күшейту процесінің кез келген нүктесінде қажетті өнімді бақылауға мүмкіндік береді (нақты уақыт режимінде оның деңгейі белгілі бір шектен жоғары өлшенеді). ДНК-ны нақты уақыт ПТР арқылы сандық бағалаудың жиі қолданылатын әдісі флуоресценцияны логарифмдік шкаладағы циклдер санына қарсы кестелеуді қамтиды. ДНК-ға негізделген флуоресценцияны анықтау шегі сигнал шуының стандартты ауытқуының 3-5 еселенгенінен белгіленеді. Флуоресценция шегінен асып түсетін циклдер саны шекті цикл (Ct) немесе MIQE нұсқауларына сәйкес сандық цикл (Cq) деп аталады. Ген экспрессиясын сандық бағалау үшін, қызығушылық тудыратын геннің РНК немесе ДНК үшін алынған (Cq) мәні, сол үлгідегі «үй шаруашылығы» генінің РНК/ДНК (Cq) мәнінен алынады, бұл әртүрлі үлгілер арасындағы РНК мөлшері мен сапасының өзгеруін нормалау үшін жасалады. Бұл нормалау процедурасы әдетте ΔCt әдісі деп аталады және әртүрлі үлгілерде қызығушылық тудыратын геннің экспрессиясын салыстыруға мүмкіндік береді. Алайда, мұндай салыстыру үшін нормалаушы эталондық геннің экспрессиясы барлық үлгілерде өте ұқсас болуы керек. Осы критерийді қанағаттандыратын эталондық генді таңдау өте маңызды және көбінесе қиын, өйткені тек аз ғана гендер әртүрлі жағдайларда немесе тіндерде бірдей экспрессия деңгейін көрсетеді. Циклдық шекті талдау көптеген коммерциялық бағдарламалық жүйелерге ендірілгенімен, қайталанатындық туралы алаңдау туындаған жағдайларда күшейту профилі деректерін талдаудың дәлірек және сенімді әдістері бар. Олар стандартты қисық әдістерімен салыстырғанда тең немесе жақсы сандық көрсеткіштерге ие екені көрсетілген. Бұл механизмге негізделген әдістер бастапқы үлгі концентрациясын бағалау үшін полимераза күшейту процесі туралы білімді пайдаланады. Бұл тәсілдің кеңейтілген нұсқасы ПТР реакциясының толық профилінің дәл моделін қамтиды, бұл жоғары сигнал-шу деректерін пайдалануға және талдаудан бұрын деректер сапасын растауға мүмкіндік береді. MAK2 ПТР реакциясы кезінде күшейту тиімділігі тұрақты деп есептейді. Алайда, MAK2 негізделген полимераза тізбектік реакциясының теориялық талдауы күшейту тиімділігі ПТР барысында тұрақты емес екенін көрсетті. MAK2 қалыпты qPCR жағдайында үлгідегі мақсатты ДНК концентрациясының сенімді бағасын ұсынса да, MAK2 бәсекелестік өлшегіштермен qPCR талдауларында мақсатты концентрацияны сенімді түрде сандық бағалай алмайды.

Unlike end point PCR (conventional PCR), real time PCR allows monitoring of the desired product at any point in the amplification process by measuring fluorescence (in real time frame, measurement is made of its level over a given threshold). A commonly employed method of DNA quantification by real time PCR relies on plotting fluorescence against the number of cycles on a logarithmic scale. A threshold for detection of DNA based fluorescence is set 3–5 times of the standard deviation of the signal noise above background. The number of cycles at which the fluorescence exceeds the threshold is called the threshold cycle (Ct) or, according to the MIQE guidelines, quantification cycle (Cq). To quantify gene expression, the (Cq) for an RNA or DNA from the gene of interest is subtracted from the (Cq) of RNA/DNA from a housekeeping gene in the same sample to normalize for variation in the amount and quality of RNA between different samples. This normalization procedure is commonly called the ΔCt method and permits comparison of expression of a gene of interest among different samples. However, for such comparison, expression of the normalizing reference gene needs to be very similar across all the samples. Choosing a reference gene fulfilling this criterion is therefore of high importance, and often challenging, because only very few genes show equal levels of expression across a range of different conditions or tissues. Although cycle threshold analysis is integrated with many commercial software systems, there are more accurate and reliable methods of analysing amplification profile data that should be considered in cases where reproducibility is a concern. have been shown to have equal or better quantitative performance to standard curve methods. These mechanism based methods use knowledge about the polymerase amplification process to generate estimates of the original sample concentration. An extension of this approach includes an accurate model of the entire PCR reaction profile, which allows for the use of high signal to noise data and the ability to validate data quality prior to analysis. MAK2 assumes constant amplification efficiency during the PCR reaction. However, theoretical analysis of polymerase chain reaction, from which MAK2 was derived, has revealed that amplification efficiency is not constant throughout PCR. While MAK2 quantification provides reliable estimates of target DNA concentration in a sample under normal qPCR conditions, MAK2 does not reliably quantify target concentration for qPCR assays with competimeters.

Қолданбалар

Лабораторияда сандық полимераза тізбекті реакциясының көптеген қолданыс салалары бар. Ол диагностикалық және фундаменталды зерттеулерде кеңінен қолданылады. Өнеркәсіптегі қолданыстарының ішінде тағамдардағы немесе өсімдік материалдарындағы микроорганизмдер мөлшерін анықтау, ГМО (генетикалық модификацияланған организмдерді) табу, сондай-ақ адам вирустық патогендерін сандық өлшеу және генотиптеу бар.

Гендік экспрессияны өлшеу

Дәстүрлі ДНК анықтау әдістерімен ген экспрессиясын өлшеу сенімді емес. Солтүстік блоттан mRNA немесе гельден немесе Оңтүстік блоттан ПТР өнімдерін анықтау нақты сандық өлшеуді қамтамасыз етпейді. Мысалы, әдеттегі ПТР-дың 20–40 циклдарында ДНК өнімінің мөлшері бастапқы ПТР-дегі мақсатты ДНК мөлшерімен тікелей байланысты емес деңгейге жетеді. Нақты уақыт ПТР-мен нуклеин қышқылдарын екі кең таралған әдіспен: салыстырмалы және абсолютті сандық өлшеу арқылы өлшеуге болады. Абсолютті сандық өлшеу калибрлеу қисығын пайдалана отырып, ДНК стандарттарымен салыстыру арқылы мақсатты ДНК молекулаларының нақты санын береді. Сондықтан үлгідегі және стандарттағы ПТР-дың күшейткіш тиімділігі бірдей болуы қажет. Салыстырмалы сандық өлшеу мақсатты геннің экспрессиясындағы өзгерісті анықтау үшін ішкі сілтеме гендеріне негізделген. Сандық бағалау мРНК экспрессия деңгейінің өзгеруі ретінде көрсетіледі (мРНК кері транскрипциясы арқылы алынған кДНК). Салыстырмалы сандық өлшеуді жүргізу оңай, себебі ол калибрлеу қисығын қажет етпейді, өйткені зерттелетін геннің мөлшері бақылаудағы эталондық геннің мөлшерімен салыстырылады. Салыстырмалы сандық өлшеу нәтижелерін білдіру үшін қолданылатын бірліктер маңызды емес болғандықтан, нәтижелерді әртүрлі RTqPCR-мен салыстыруға болады. Бір немесе бірнеше «үй шаруашылығы» гендерін пайдаланудың себебі – кері транскрипцияның тиімділігіне және осылайша бүкіл ПТР процесінің тиімділігіне әсер ететін пайдаланылатын РНК мөлшері мен сапасындағы айырмашылықтар сияқты ерекше емес өзгерістерді түзету. Алайда, процестің ең маңызды аспектісі – сілтеме геннің тұрақты болуы. Бұл сілтеме гендерді таңдау дәстүрлі түрде молекулалық биологияда сапалық немесе жартылай сандық зерттеулер арқылы жүргізілді, мысалы, РНК гельдерін визуалды қарау, солтүстік блот денситометриясы немесе жартылай сандық ПТР (ПТР имитациялары). Қазір геном дәуірінде транскриптомдық технологияларды қолдана отырып, көптеген организмдер үшін егжей-тегжейлі бағалау жүргізуге болады. Алайда зерттеулер көрсеткендей, мРНК экспрессиясын өлшеу үшін қолданылатын көптеген сілтеме гендердің күшеюі тәжірибелік жағдайларға байланысты өзгереді. Сондықтан ең қолайлы сілтеме генді таңдау үшін статистикалық тұрғыдан дұрыс әдістемелік зерттеу жүргізу қажет. Белгілі бір жағдайларда қай ген немесе гендер ең қолайлы екенін анықтайтын бірқатар статистикалық алгоритмдер әзірленді. GeNORM немесе BestKeeper сияқты алгоритмдер әртүрлі сілтеме гендері мен тіндерінің матрицасы үшін жұптарды немесе геометриялық орташаларды салыстыра алады. Қатерлі ісік және генетикалық аномалиялар. Клиникалық микробиология зертханасына сапалық ПТР-тестілеуді енгізу жұқпалы ауруларды диагностикалауды айтарлықтай жақсартты және диагностикалық тесттерде тұмау мен коронавирустың жаңа штаммдары сияқты жаңа пайда болған ауруларды анықтау құралы ретінде қолданылады.

Quantifying gene expression by traditional DNA detection methods is unreliable. Detection of mRNA on a northern blot or PCR products on a gel or Southern blot does not allow precise quantification. For example, over the 20–40 cycles of a typical PCR, the amount of DNA product reaches a plateau that is not directly correlated with the amount of target DNA in the initial PCR. Real time PCR can be used to quantify nucleic acids by two common methods: relative quantification and absolute quantification. Absolute quantification gives the exact number of target DNA molecules by comparison with DNA standards using a calibration curve. It is therefore essential that the PCR of the sample and the standard have the same amplification efficiency. Relative quantification is based on internal reference genes to determine fold differences in expression of the target gene. The quantification is expressed as the change in expression levels of mRNA interpreted as complementary DNA (cDNA, generated by reverse transcription of mRNA). Relative quantification is easier to carry out as it does not require a calibration curve as the amount of the studied gene is compared to the amount of a control reference gene. As the units used to express the results of relative quantification are unimportant the results can be compared across a number of different RTqPCR. The reason for using one or more housekeeping genes is to correct non specific variation, such as the differences in the quantity and quality of RNA used, which can affect the efficiency of reverse transcription and therefore that of the whole PCR process. However, the most crucial aspect of the process is that the reference gene must be stable. The selection of these reference genes was traditionally carried out in molecular biology using qualitative or semi quantitative studies such as the visual examination of RNA gels, northern blot densitometry or semi quantitative PCR (PCR mimics). Now, in the genome era, it is possible to carry out a more detailed estimate for many organisms using transcriptomic technologies. However, research has shown that amplification of the majority of reference genes used in quantifying the expression of mRNA varies according to experimental conditions. It is therefore necessary to carry out an initial statistically sound methodological study in order to select the most suitable reference gene. A number of statistical algorithms have been developed that can detect which gene or genes are most suitable for use under given conditions. Those like geNORM or BestKeeper can compare pairs or geometric means for a matrix of different reference genes and tissues. cancer and genetic abnormalities. The introduction of qualitative PCR assays to the clinical microbiology laboratory has significantly improved the diagnosis of infectious diseases, and is deployed as a tool to detect newly emerging diseases, such as new strains of flu and coronavirus, in diagnostic tests.

Микробиологиялық қолданыстар

Сандық ПТР тағам қауіпсіздігі, тағамның бұзылуы және ферментация салаларында жұмыс істейтін микробиологтар тарапынан, сондай-ақ су сапасының (ішуге және рекреациялық сулардың) микробиологиялық тәуекелдерін бағалау және халық денсаулығын қорғау мақсатында қолданылады. qPCR қоршаған ортадан алынған ДНК-дағы гендердің таксономиялық немесе функционалдық маркерлерін күшейту үшін де пайдаланылуы мүмкін.

Фитопатогендерді анықтау

Ауыл шаруашылығы саласы экономикалық зиянды болдырмау және денсаулықты қорғау мақсатында патогендерден таза өсімдік көшеттері мен қалдықтарын өндіруге үнемі тырысады. Емен және басқа да түрлерді қырып тастайтын омицет – Фитофтора раморумның ДНК-сының, жазындыр ұяшық өсімдігінің ДНК-сымен араласқан кішкентай мөлшерін анықтауға мүмкіндік беретін жүйелер жасалған. Патогеннің және өсімдіктің ДНК-сын ажырату, рибосомалық РНК генінің кодтау аймағында орналасқан ITS тізбектерінің күшеюіне негізделген, бұл тізбектер әр таксонға тән. Осы техниканың дала жағдайында қолданылатын нұсқалары да осы патогенді анықтау үшін әзірленді.

Генетикалық модификацияланған организмдерді анықтау

Кері транскрипция қолданылатын qPCR (RT qPCR) ДНҚ-ны анықтаудағы жоғары сезімталдығы мен динамикалық диапазоны болғандықтан ГМО-ны анықтау үшін қолданылуы мүмкін. ДНҚ немесе ақуыз талдауы сияқты балама әдістер көбінесе аз сезімтал болады. Арнайы праймерлер трансгенді емес, векторды жасау процесінде қолданылатын промоторды, терминаторды немесе аралық тізбектерді күшейтеді. Трансгендік өсімдік құру процесі әдетте трансгеннің бірнеше көшірмесін енгізуге алып келетіндіктен, оның саны да жиі бағаланады. Бұл көбінесе тек бір данада болатын өңделген түрдің бақылау генін пайдаланып салыстырмалы сандық бағалау арқылы жүзеге асырылады.

Клиникалық сандық анықтау және генотипі

Адамдарда вирустар тікелей жұқтыру немесе бірнеше вирустың бірдей жұқтыруы арқылы пайда болуы мүмкін, бұл классикалық әдістермен диагноз қоюды қиындатады және дұрыс емес болжам мен емдеуге алып келуі мүмкін. qPCR қолдану гепатит B вирусы сияқты вирустың мөлшерін анықтауға және генотипілеуге (штаммның сипаттамасын, балқыту қисықтары арқылы жүзеге асыру) мүмкіндік береді. Көптеген жағдайларда, инфекцияның дәрежесі, пациенттің тінінің бірлігіне шаққандағы вирус геномының көшірмелері түрінде өлшенгенде, маңызды болып табылады; мысалы, 1-типті герпес симплекс вирусының қайта белсенді болу ықтималдығы ганглиядағы жұқтырылған нейрондардың санымен байланысты. Бұл мөлшерлік анықтама кері транскрипция арқылы немесе одан без жүргізіледі, себебі вирус өмірлік циклінің кез келген кезеңінде адам геномына еніп кетсе, мысалы, адам папиллома вирусы (HPV) жағдайында, оның кейбір түрлері жатыр мойнының қатерлі ісігінің пайда болуымен байланысты. Нақты уақыт ПТР сонымен қатар, қатты мүшелер немесе сүйек миын трансплантациялағаннан кейін иммундық жүйесі әлсіреген науқастарда кездесетін адам цитомегаловирусын (CMV) мөлшерлеуге мүмкіндік берді.