Реальный времени ПЦР: принципы и применение в молекулярной биологии.

Реальный времени ПЦР (qPCR) – метод молекулярной биологии для амплификации ДНК. Количественный анализ, флуоресцентные красители и зонды. MIQE рекомендации.

14 мин чтения

100%

Источник: Real-time polymerase chain reaction — Wikipedia

Сравнивайте с английским: нажмите на абзац — оригинал откроется в окне. Кнопка EN под абзацем показывает его прямо в тексте.

Содержание

Введение

Лабораторная техника молекулярной биологии обратная транскрипционная полимеразная цепная реакция (RT PCR)

Полимеразная цепная реакция в реальном времени (ПЦР в реальном времени, или qPCR при количественном использовании) – это лабораторная техника молекулярной биологии, основанная на полимеразной цепной реакции (ПЦР). Она контролирует амплификацию целевой молекулы ДНК в процессе ПЦР (то есть в реальном времени), а не по ее завершении, как в обычной ПЦР. ПЦР в реальном времени может использоваться для количественного и полуколичественного анализа (то есть для определения количества молекул ДНК выше или ниже определенного порога). Два распространенных метода для обнаружения продуктов ПЦР в реальном времени включают (1) неспецифические флуоресцентные красители, интеркалирующие любую двухцепочечную ДНК, и (2) специфические ДНК-зонды, состоящие из олигонуклеотидов, меченных флуоресцентным репортером, что позволяет обнаруживать продукт только после гибридизации зонда с комплементарной последовательностью. Руководство по минимальному набору информации для публикации количественных экспериментов ПЦР в реальном времени (MIQE) рекомендует использовать аббревиатуру qPCR для обозначения количественной ПЦР в реальном времени и RT qPCR для обозначения обратной транскрипции с последующей qPCR. Акроним "RT PCR" обычно обозначает обратную транскрипционную полимеразную цепную реакцию, а не ПЦР в реальном времени, хотя не все авторы следуют этому соглашению.

Предыстория

Клетки во всех организмах регулируют экспрессию генов путем обновления транскриптов генов (одноцепочечная РНК): количество экспрессированного гена в клетке можно измерить по числу копий РНК-транскрипта этого гена, присутствующего в образце. Для надежного обнаружения и количественного определения экспрессии генов из небольшого количества РНК необходимо усиление транскрипта гена. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) – распространенный метод амплификации ДНК; для ПЦР на основе РНК образец РНК сначала обратной транскрибируется в комплементарную ДНК (кДНК) с помощью обратной транскриптазы. Для амплификации небольшого количества ДНК используется та же методология, что и в обычной ПЦР, с использованием ДНК-матрицы, как минимум одной пары специфических праймеров, дезоксирибонуклеотидных трифосфатов, подходящего буферного раствора и термостабильной ДНК-полимеразы. В смесь добавляется вещество, меченное флуорофором, в термоциклер, который содержит датчики для измерения флуоресценции флуорофора после его возбуждения на необходимой длине волны, что позволяет измерять скорость образования одного или нескольких специфических продуктов. Это позволяет измерять скорость образования амплифицированного продукта на каждом цикле ПЦР. Полученные данные можно проанализировать с помощью компьютерного программного обеспечения для расчета относительной экспрессии генов (или числа копий мРНК) в нескольких образцах. Количественная ПЦР также может применяться для обнаружения и количественного определения ДНК в образцах для определения наличия и количества определенной последовательности ДНК в этих образцах. Это измерение проводится после каждого цикла амплификации, и поэтому этот метод называется ПЦР в реальном времени (то есть немедленной или одновременной ПЦР). Количественная ПЦР и ДНК-микрочипы – современные методы изучения экспрессии генов. Для измерения обилия мРНК использовались более ранние методы: дифференциальный дисплей, анализ защиты РНКазой и нотерн-блоттинг. Нотерн-блоттинг часто используется для оценки уровня экспрессии гена путем визуализации обилия его мРНК-транскрипта в образце. В этом методе очищенная РНК разделяется электрофорезом в агарозном геле, переносится на твердую матрицу (например, на нейлоновую мембрану) и гибридизуется со специфическим ДНК- или РНК-зондом, комплементарным интересующему гену. Хотя этот метод все еще используется для оценки экспрессии генов, он требует относительно большого количества РНК и предоставляет только качественную или полуколичественную информацию об уровнях мРНК. Ошибки в оценке, возникающие из-за различий в методе количественного определения, могут быть вызваны целостностью ДНК, эффективностью ферментов и многими другими факторами. По этой причине был разработан ряд систем стандартизации (часто называемых методами нормализации). Некоторые из них разработаны для количественного определения общей экспрессии генов, но наиболее распространенные направлены на количественное определение конкретного изучаемого гена по отношению к другому гену, называемому нормализующим геном, который выбирается из-за его почти постоянного уровня экспрессии. Эти гены часто выбираются из генов домашнего хозяйства, поскольку их функции, связанные с базовым выживанием клеток, обычно подразумевают конститутивную экспрессию генов. Это позволяет исследователям сообщать об отношении экспрессии интересующих генов к экспрессии выбранного нормализатора, тем самым позволяя сравнивать первое, не зная его абсолютного уровня экспрессии. Наиболее часто используемые нормализующие гены кодируют следующие молекулы: тубулин, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу, альбумин, циклофилин и рибосомные РНК. Третий этап, при температуре от 68 до 72 °C, способствует полимеризации, осуществляемой ДНК-полимеразой. Из-за небольшого размера фрагментов последний этап обычно опускается в этом типе ПЦР, поскольку фермент способен реплицировать ампликон ДНК во время перехода между стадией отжига и стадией денатурации. Кроме того, в ПЦР в четыре этапа флуоресценция измеряется во время коротких температурных фаз, длящихся всего несколько секунд в каждом цикле, при температуре, например, 80 °C, чтобы уменьшить сигнал, вызванный наличием димеров праймеров при использовании неспецифического красителя. Температуры и время, используемые для каждого цикла, зависят от множества параметров, таких как: используемый для синтеза ДНК фермент, концентрация двухвалентных ионов и дезоксирибонуклеотидных трифосфатов (dNTP) в реакции и температура отжига праймеров.

Cells in all organisms regulate gene expression by turnover of gene transcripts (single stranded RNA): The amount of an expressed gene in a cell can be measured by the number of copies of an RNA transcript of that gene present in a sample. In order to robustly detect and quantify gene expression from small amounts of RNA, amplification of the gene transcript is necessary. The polymerase chain reaction (PCR) is a common method for amplifying DNA; for RNA based PCR the RNA sample is first reverse transcribed to complementary DNA (cDNA) with reverse transcriptase. In order to amplify small amounts of DNA, the same methodology is used as in conventional PCR using a DNA template, at least one pair of specific primers, deoxyribonucleotide triphosphates, a suitable buffer solution and a thermo stable DNA polymerase. A substance marked with a fluorophore is added to this mixture in a thermal cycler that contains sensors for measuring the fluorescence of the fluorophore after it has been excited at the required wavelength allowing the generation rate to be measured for one or more specific products. This allows the rate of generation of the amplified product to be measured at each PCR cycle. The data thus generated can be analysed by computer software to calculate relative gene expression (or mRNA copy number) in several samples. Quantitative PCR can also be applied to the detection and quantification of DNA in samples to determine the presence and abundance of a particular DNA sequence in these samples. This measurement is made after each amplification cycle, and this is the reason why this method is called real time PCR (that is, immediate or simultaneous PCR). Quantitative PCR and DNA microarray are modern methodologies for studying gene expression. Older methods were used to measure mRNA abundance: differential display, RNase protection assay and northern blot. Northern blotting is often used to estimate the expression level of a gene by visualizing the abundance of its mRNA transcript in a sample. In this method, purified RNA is separated by agarose gel electrophoresis, transferred to a solid matrix (such as a nylon membrane), and probed with a specific DNA or RNA probe that is complementary to the gene of interest. Although this technique is still used to assess gene expression, it requires relatively large amounts of RNA and provides only qualitative or semi quantitative information of mRNA levels. Estimation errors arising from variations in the quantification method can be the result of DNA integrity, enzyme efficiency and many other factors. For this reason a number of standardization systems (often called normalization methods) have been developed. Some have been developed for quantifying total gene expression, but the most common are aimed at quantifying the specific gene being studied in relation to another gene called a normalizing gene, which is selected for its almost constant level of expression. These genes are often selected from housekeeping genes as their functions related to basic cellular survival normally imply constitutive gene expression. This enables researchers to report a ratio for the expression of the genes of interest divided by the expression of the selected normalizer, thereby allowing comparison of the former without actually knowing its absolute level of expression. The most commonly used normalizing genes are those that code for the following molecules: tubulin, glyceraldehyde 3 phosphate dehydrogenase, albumin, cyclophilin, and ribosomal RNAs. the third, at between 68 and 72 °C, facilitates the polymerization carried out by the DNA polymerase. Due to the small size of the fragments the last step is usually omitted in this type of PCR as the enzyme is able to replicate the DNA amplicon during the change between the alignment stage and the denaturing stage. In addition, in four step PCR the fluorescence is measured during short temperature phases lasting only a few seconds in each cycle, with a temperature of, for example, 80 °C, in order to reduce the signal caused by the presence of primer dimers when a non specific dye is used. The temperatures and the timings used for each cycle depend on a wide variety of parameters, such as: the enzyme used to synthesize the DNA, the concentration of divalent ions and deoxyribonucleotide triphosphates (dNTPs) in the reaction and the bonding temperature of the primers.

Химическая классификация

Техника ПЦР в реальном времени может быть классифицирована по химии, используемой для детекции продукта ПЦР, а также по типу используемых флуорохромов – специфических или неспецифических.

Неспецифическое обнаружение: ПЦР в реальном времени с использованием двустворчатых ДНК-связывающих красителей в качестве репортеров

Краситель, связывающийся с ДНК, связывается со всей двуцепочечной (дс) ДНК в ПЦР, увеличивая квантовый выход флуоресценции красителя. Соответственно, увеличение количества продукта ДНК в ходе ПЦР приводит к увеличению интенсивности флуоресценции, измеряемой на каждом цикле. Однако, красители для дсДНК, такие как SYBR Green, связываются со всеми продуктами ПЦР дсДНК, включая неспецифические продукты ПЦР (например, димеры праймеров). Это может потенциально мешать или препятствовать точному мониторингу целевой последовательности. В ПЦР в реальном времени с использованием красителей дсДНК реакция готовится обычным образом, с добавлением флуоресцентного красителя дсДНК. Затем реакция проводится в приборе для ПЦР в реальном времени, и после каждого цикла измеряется интенсивность флуоресценции с помощью детектора; краситель флуоресцирует только при связывании с дсДНК (то есть с продуктом ПЦР). Преимущество этого метода заключается в том, что для проведения амплификации требуется только одна пара праймеров, что снижает стоимость; несколько целевых последовательностей можно контролировать в одной пробирке, используя различные типы красителей.

Специфическое обнаружение: флуоресцентный метод детектора

Флуоресцентные репортерные зонды обнаруживают только ДНК, содержащую последовательность, комплементарную зонду; поэтому использование репортерного зонда значительно повышает специфичность и позволяет проводить анализ даже в присутствии другой двухцепочечной ДНК. Используя различные цветные метки, флуоресцентные зонды могут применяться в мультиплексных анализах для мониторинга нескольких целевых последовательностей в одной пробирке. Специфичность флуоресцентных репортерных зондов также предотвращает помехи в измерениях, вызванные димерами праймеров – нежелательными побочными продуктами ПЦР. Однако флуоресцентные репортерные зонды не устраняют ингибирующее действие димеров праймеров, которое может подавлять накопление целевых продуктов в реакции. Метод основан на ДНК-зонде с флуоресцентным репортером на одном конце и гасителем флуоресценции на противоположном конце зонда. Близкое расположение репортера и гасителя препятствует обнаружению флуоресценции; расщепление зонда 5'-3' экзонуклеазной активностью Taq-полимеразы разрушает близость репортера и гасителя, что позволяет нескомпенсированной флуоресценции излучаться и быть обнаруженной после возбуждения лазером. Увеличение количества продукта, на который нацелен репортерный зонд, с каждым циклом ПЦР, таким образом, вызывает пропорциональное увеличение флуоресценции из-за расщепления зонда и высвобождения репортера. ПЦР подготавливается обычным способом (см. ПЦР), и добавляется репортерный зонд. По мере начала реакции, во время стадии отжига ПЦР, как зонд, так и праймеры отжигаются к ДНК-мишени. Полимеризация новой цепи ДНК инициируется с праймеров, и как только полимераза достигает зонда, ее 5'-3' экзонуклеаза деградирует зонд, физически разделяя флуоресцентный репортер и гаситель, что приводит к увеличению флуоресценции. Флуоресценция обнаруживается и измеряется в приборе для ПЦР в реальном времени, а ее геометрическое увеличение, соответствующее экспоненциальному росту продукта, используется для определения цикла количественного определения (Cq) в каждой реакции.

Fluorescent reporter probes detect only the DNA containing the sequence complementary to the probe; therefore, use of the reporter probe significantly increases specificity, and enables performing the technique even in the presence of other dsDNA. Using different coloured labels, fluorescent probes can be used in multiplex assays for monitoring several target sequences in the same tube. The specificity of fluorescent reporter probes also prevents interference of measurements caused by primer dimers, which are undesirable potential by products in PCR. However, fluorescent reporter probes do not prevent the inhibitory effect of the primer dimers, which may depress accumulation of the desired products in the reaction. The method relies on a DNA based probe with a fluorescent reporter at one end and a quencher of fluorescence at the opposite end of the probe. The close proximity of the reporter to the quencher prevents detection of its fluorescence; breakdown of the probe by the 5' to 3' exonuclease activity of the Taq polymerase breaks the reporter quencher proximity and thus allows unquenched emission of fluorescence, which can be detected after excitation with a laser. An increase in the product targeted by the reporter probe at each PCR cycle therefore causes a proportional increase in fluorescence due to the breakdown of the probe and release of the reporter. The PCR is prepared as usual (see PCR), and the reporter probe is added. As the reaction commences, during the annealing stage of the PCR both probe and primers anneal to the DNA target. Polymerisation of a new DNA strand is initiated from the primers, and once the polymerase reaches the probe, its 5' 3' exonuclease degrades the probe, physically separating the fluorescent reporter from the quencher, resulting in an increase in fluorescence. Fluorescence is detected and measured in a real time PCR machine, and its geometric increase corresponding to exponential increase of the product is used to determine the quantification cycle (Cq) in each reaction.

Анализ температуры плавления

ПЦР в реальном времени позволяет идентифицировать специфические, амплифицированные фрагменты ДНК путем анализа их температуры плавления (также называемой значением Tm, от температуры плавления). Обычно используется ПЦР с интеркалирующими красителями, связывающимися с двуцепочечной ДНК, в качестве репортеров, и наиболее часто применяемым красителем является SYBR Green. Температура плавления ДНК специфична для амплифицированного фрагмента. Результаты, полученные с помощью этой методики, основаны на сравнении кривых диссоциации анализируемых образцов ДНК. В отличие от традиционной ПЦР, данный метод позволяет избежать предварительного использования электрофореза для визуализации результатов по всем образцам. Это обусловлено тем, что, несмотря на то, что количественная ПЦР является кинетическим методом, ее оценка обычно производится в определенной конечной точке. Таким образом, эта методика обычно обеспечивает более быстрые результаты и/или требует меньшего количества реагентов, чем электрофорез. Если требуется последующий электрофорез, необходимо исследовать только те образцы, которые ПЦР в реальном времени показала как сомнительные, и/или подтвердить результаты для образцов, положительных по конкретному детерминанту.

Моделирование

В отличие от конечной ПЦР (обычной ПЦР), ПЦР в реальном времени позволяет контролировать целевой продукт на любом этапе процесса амплификации путем измерения флуоресценции (измерение в реальном времени производится по уровню, превышающему заданный порог). Распространенный метод количественной оценки ДНК с помощью ПЦР в реальном времени основан на построении графика зависимости флуоресценции от количества циклов в логарифмическом масштабе. Порог для обнаружения флуоресценции, основанной на ДНК, устанавливается в 3–5 раз выше стандартного отклонения шума сигнала над фоном. Количество циклов, на котором флуоресценция превышает порог, называется пороговым циклом (Ct) или, согласно рекомендациям MIQE, количественным циклом (Cq). Для количественной оценки экспрессии генов значение (Cq) для РНК или ДНК интересующего гена вычитается из значения (Cq) РНК/ДНК гена домашнего хозяйства в том же образце для нормализации различий в количестве и качестве РНК между разными образцами. Эта процедура нормализации обычно называется методом ΔCt и позволяет сравнивать экспрессию интересующего гена между различными образцами. Однако для такого сравнения экспрессия нормализующего референтного гена должна быть очень сходной во всех образцах. Поэтому выбор референтного гена, соответствующего этому критерию, имеет большое значение и часто является сложной задачей, поскольку лишь немногие гены демонстрируют одинаковый уровень экспрессии в широком диапазоне различных условий или тканей. Хотя анализ порогового цикла интегрирован во многие коммерческие программные системы, существуют более точные и надежные методы анализа данных профиля амплификации, которые следует учитывать в случаях, когда важна воспроизводимость. Показано, что они обладают равной или лучшей количественной производительностью по сравнению со стандартными методами, основанными на калибровочной кривой. Эти методы, основанные на механизмах, используют знания о процессе амплификации полимеразы для оценки исходной концентрации образца. Расширение этого подхода включает в себя точную модель всего профиля ПЦР-реакции, что позволяет использовать данные с высоким соотношением сигнал/шум и проверять качество данных перед анализом. MAK2 предполагает постоянную эффективность амплификации в течение ПЦР-реакции. Однако теоретический анализ полимеразной цепной реакции, на основе которого был разработан MAK2, показал, что эффективность амплификации не является постоянной на протяжении всей ПЦР. В то время как количественная оценка с помощью MAK2 обеспечивает надежные оценки концентрации целевой ДНК в образце при нормальных условиях qPCR, MAK2 не позволяет достоверно количественно оценить целевую концентрацию для qPCR-анализов с использованием конкурентных методов.

Unlike end point PCR (conventional PCR), real time PCR allows monitoring of the desired product at any point in the amplification process by measuring fluorescence (in real time frame, measurement is made of its level over a given threshold). A commonly employed method of DNA quantification by real time PCR relies on plotting fluorescence against the number of cycles on a logarithmic scale. A threshold for detection of DNA based fluorescence is set 3–5 times of the standard deviation of the signal noise above background. The number of cycles at which the fluorescence exceeds the threshold is called the threshold cycle (Ct) or, according to the MIQE guidelines, quantification cycle (Cq). To quantify gene expression, the (Cq) for an RNA or DNA from the gene of interest is subtracted from the (Cq) of RNA/DNA from a housekeeping gene in the same sample to normalize for variation in the amount and quality of RNA between different samples. This normalization procedure is commonly called the ΔCt method and permits comparison of expression of a gene of interest among different samples. However, for such comparison, expression of the normalizing reference gene needs to be very similar across all the samples. Choosing a reference gene fulfilling this criterion is therefore of high importance, and often challenging, because only very few genes show equal levels of expression across a range of different conditions or tissues. Although cycle threshold analysis is integrated with many commercial software systems, there are more accurate and reliable methods of analysing amplification profile data that should be considered in cases where reproducibility is a concern. have been shown to have equal or better quantitative performance to standard curve methods. These mechanism based methods use knowledge about the polymerase amplification process to generate estimates of the original sample concentration. An extension of this approach includes an accurate model of the entire PCR reaction profile, which allows for the use of high signal to noise data and the ability to validate data quality prior to analysis. MAK2 assumes constant amplification efficiency during the PCR reaction. However, theoretical analysis of polymerase chain reaction, from which MAK2 was derived, has revealed that amplification efficiency is not constant throughout PCR. While MAK2 quantification provides reliable estimates of target DNA concentration in a sample under normal qPCR conditions, MAK2 does not reliably quantify target concentration for qPCR assays with competimeters.

Приложения

Существует множество применений количественной полимеразной цепной реакции в лаборатории. Она широко используется как в диагностике, так и в фундаментальных исследованиях. В промышленности эта техника применяется для количественного определения микробной нагрузки в продуктах питания или на растительном сырье, для обнаружения ГМО (генетически модифицированных организмов), а также для количественного определения и генотипирования человеческих вирусных патогенов.

Количественная оценка экспрессии генов

Количественное определение экспрессии генов традиционными методами детекции ДНК ненадежно. Детекция мРНК на северном блотте или ПЦР-продуктов на геле или южном блотте не позволяет проводить точную количественную оценку. Например, в течение 20–40 циклов типичной ПЦР количество продукта ДНК достигает плато, которое не напрямую коррелирует с количеством целевой ДНК в исходной ПЦР. Полимеразная цепная реакция в реальном времени (ПЦР в реальном времени) может быть использована для количественного определения нуклеиновых кислот двумя распространенными методами: относительной и абсолютной количественной оценкой. Абсолютная количественная оценка дает точное число молекул целевой ДНК путем сравнения со стандартами ДНК с использованием калибровочной кривой. Поэтому необходимо, чтобы ПЦР образца и стандарта имели одинаковую эффективность амплификации. Относительная количественная оценка основана на внутренних референтных генах для определения кратных различий в экспрессии целевого гена. Количественная оценка выражается как изменение уровней экспрессии мРНК, интерпретируемой как комплементарная ДНК (кДНК, полученная путем обратной транскрипции мРНК). Относительную количественную оценку проще проводить, поскольку она не требует калибровочной кривой, так как количество изучаемого гена сравнивается с количеством контрольного референтного гена. Поскольку единицы измерения, используемые для выражения результатов относительной количественной оценки, не имеют значения, результаты можно сравнивать между различными RT-qPCR. Причина использования одного или нескольких генов «домашнего хозяйства» заключается в коррекции неспецифической изменчивости, такой как различия в количестве и качестве используемой РНК, которые могут влиять на эффективность обратной транскрипции и, следовательно, на эффективность всего процесса ПЦР. Однако наиболее важным аспектом процесса является стабильность референтного гена. Выбор этих референтных генов традиционно осуществлялся в молекулярной биологии с использованием качественных или полуколичественных исследований, таких как визуальная оценка гелей РНК, денситометрия северного блоттинга или полуколичественная ПЦР (ПЦР-мимик). В эпоху геномики стало возможным проводить более детальную оценку для многих организмов с использованием транскриптомных технологий. Однако исследования показали, что амплификация большинства референтных генов, используемых для количественной оценки экспрессии мРНК, варьируется в зависимости от экспериментальных условий. Поэтому необходимо провести первоначальное статистически обоснованное методологическое исследование для выбора наиболее подходящего референтного гена. Разработано несколько статистических алгоритмов, которые могут определить, какой ген или гены наиболее подходят для использования в заданных условиях. Такие алгоритмы, как geNORM или BestKeeper, могут сравнивать пары или геометрические средние для матрицы различных референтных генов и тканей, при раке и генетических аномалиях. Внедрение качественных ПЦР-анализов в клиническую микробиологическую лабораторию значительно улучшило диагностику инфекционных заболеваний и используется в качестве инструмента для выявления новых возникающих заболеваний, таких как новые штаммы гриппа и коронавируса, в диагностических тестах.

Quantifying gene expression by traditional DNA detection methods is unreliable. Detection of mRNA on a northern blot or PCR products on a gel or Southern blot does not allow precise quantification. For example, over the 20–40 cycles of a typical PCR, the amount of DNA product reaches a plateau that is not directly correlated with the amount of target DNA in the initial PCR. Real time PCR can be used to quantify nucleic acids by two common methods: relative quantification and absolute quantification. Absolute quantification gives the exact number of target DNA molecules by comparison with DNA standards using a calibration curve. It is therefore essential that the PCR of the sample and the standard have the same amplification efficiency. Relative quantification is based on internal reference genes to determine fold differences in expression of the target gene. The quantification is expressed as the change in expression levels of mRNA interpreted as complementary DNA (cDNA, generated by reverse transcription of mRNA). Relative quantification is easier to carry out as it does not require a calibration curve as the amount of the studied gene is compared to the amount of a control reference gene. As the units used to express the results of relative quantification are unimportant the results can be compared across a number of different RTqPCR. The reason for using one or more housekeeping genes is to correct non specific variation, such as the differences in the quantity and quality of RNA used, which can affect the efficiency of reverse transcription and therefore that of the whole PCR process. However, the most crucial aspect of the process is that the reference gene must be stable. The selection of these reference genes was traditionally carried out in molecular biology using qualitative or semi quantitative studies such as the visual examination of RNA gels, northern blot densitometry or semi quantitative PCR (PCR mimics). Now, in the genome era, it is possible to carry out a more detailed estimate for many organisms using transcriptomic technologies. However, research has shown that amplification of the majority of reference genes used in quantifying the expression of mRNA varies according to experimental conditions. It is therefore necessary to carry out an initial statistically sound methodological study in order to select the most suitable reference gene. A number of statistical algorithms have been developed that can detect which gene or genes are most suitable for use under given conditions. Those like geNORM or BestKeeper can compare pairs or geometric means for a matrix of different reference genes and tissues. cancer and genetic abnormalities. The introduction of qualitative PCR assays to the clinical microbiology laboratory has significantly improved the diagnosis of infectious diseases, and is deployed as a tool to detect newly emerging diseases, such as new strains of flu and coronavirus, in diagnostic tests.

Микробиологическое применение

Количественная ПЦР также используется микробиологами, работающими в областях безопасности пищевых продуктов, порчи продуктов питания и ферментации, а также для микробиологической оценки рисков, связанных с качеством воды (питьевой и рекреационной) и для защиты общественного здоровья. qPCR также может применяться для амплификации таксономических или функциональных маркеров генов в ДНК, выделенной из образцов окружающей среды.

Выявление фитопатогенов

Сельскохозяйственная отрасль постоянно стремится к производству растительных пропагул или рассады, свободной от патогенов, для предотвращения экономических потерь и защиты здоровья. Разработаны системы, позволяющие обнаруживать небольшие количества ДНК Phytophthora ramorum, оомицета, вызывающего гибель дубов и других видов, в смеси с ДНК растения-хозяина. Различение ДНК патогена и растения основано на амплификации ITS-последовательностей – спейсеров, расположенных в кодирующей области генов рибосомальной РНК, которые характерны для каждого таксона. Также разработаны полевые варианты этой методики для идентификации того же патогена.

Обнаружение генетически модифицированных организмов

qPCR с использованием обратной транскрипции (RT qPCR) может быть использован для обнаружения ГМО благодаря своей высокой чувствительности и широкому динамическому диапазону при детекции ДНК. Альтернативные методы, такие как анализ ДНК или белков, как правило, менее чувствительны. Используются специфические праймеры, которые амплифицируют не сам трансген, а промотор, терминатор или даже промежуточные последовательности, используемые при создании вектора. Поскольку процесс получения трансгенного растения обычно приводит к встраиванию более чем одной копии трансгена, также часто оценивается и его количество. Это обычно выполняется посредством относительной количественной оценки с использованием контрольного гена из исследуемого организма, присутствующего в одной копии.

Клиническая количественная оценка и определение генотипа

Вирусы могут присутствовать в организме человека в результате прямой инфекции или коинфекций, что затрудняет диагностику с использованием классических методов и может привести к неверному прогнозу и лечению. Использование qPCR позволяет не только количественно определять, но и генотипировать (характеризовать штамм, что осуществляется с помощью анализа кривых плавления) вирус, например, вирус гепатита B. Степень инфекции, количественно оцениваемая как количество копий вирусного генома на единицу ткани пациента, во многих случаях имеет значение; например, вероятность реактивации вируса простого герпеса 1 типа связана с числом инфицированных нейронов в ганглиях. Это количественное определение проводится либо с обратной транскрипцией, либо без нее, если вирус интегрируется в геном человека на каком-либо этапе своего жизненного цикла, как это происходит в случае ВПЧ (вируса папилломы человека), некоторые варианты которого связаны с развитием рака шейки матки. ПЦР в реальном времени также позволила количественно определять цитомегаловирус человека (ЦМВ), который выявляется у пациентов с иммуносупрессией после трансплантации органов или костного мозга.