N-этилмалеимид (NEM): малеин қышқылынан алынған органикалық қосылыс. Пептидтердегі цистеин тозаңдарын өзгертуге қолданылады, тиолдармен реакцияға түседі.
Ағылшыншамен салыстырыңыз: абзацты басыңыз — түпнұсқа терезеде ашылады. Абзац астындағы EN түймесі оны мәтін ішінде көрсетеді.
Мазмұны
Кіріспе
Малеин қышқылынан туындаған органикалық қосылыс.
Organic compound derived from maleic acid
N-этилмалеимид (NEM) – малеин қышқылынан алынған органикалық қосылыс. Ол амид функционалдық тобын қамтиды, бірақ ең бастысы – тиолдармен реакцияға түсетін алкен және белоктар мен пептидтердегі цистеин қалдықтарын модификациялау үшін кеңінен қолданылады.
N Ethylmaleimide (NEM) is an organic compound that is derived from maleic acid. It contains the amide functional group, but more importantly it is an alkene that is reactive toward thiols and is commonly used to modify cysteine residues in proteins and peptides.
Органикалық химия
NEM – Михаэль реакциясында Михаэль акцепторы болып табылады, яғни тиолдар сияқты нуклеофилдерді қосады. Нәтижесінде пайда болатын тиоэфирде күшті C-S байланысы бар және реакция дерлік қайтымсыз болады. Тиолдармен реакция pH 6,5–7,5 диапазонында жүзеге асады, ал NEM көбірек сілтілік pH-та аминдермен реакцияға түсуі немесе гидролизденуі мүмкін. NEM ферменттануда тиол топтарының функционалдық рөлін зерттеу үшін кеңінен қолданылады. NEM – барлық цистеин пептидазаларының қайтымсыз ингибиторы, ал алкилдеу белсенді ортадағы тиолдық топта жүзеге асады (схеманы қараңыз).
NEM is a Michael acceptor in the Michael reaction, which means that it adds nucleophiles such as thiols. The resulting thioether features a strong C S bond and the reaction is virtually irreversible. Reaction with thiols occur in the pH range 6.5–7.5, NEM may react with amines or undergo hydrolysis at a more alkaline pH. NEM has been widely used to probe the functional role of thiol groups in enzymology. NEM is an irreversible inhibitor of all cysteine peptidases, with alkylation occurring at the active site thiol group (see schematic).
Кейс-студиялар
NEM көпіршік тасымалын тоқтатады. Лизистік буферлерде 20-25 мМ NEM Western Blot талдауы үшін ақуыздардың десумойляциялануын тежеу үшін қолданылады. NEM деубиквитиназалардың ингибиторы ретінде де пайдаланылған. Артур Корнберг және оның әріптестері ДНК полимераза III-ті жою үшін, оның активтілігін ДНК полимераза I-ге (сәйкесінше pol III және I) салыстыру үшін N-этилмалеимидті қолданды. Корнберг pol I-ді ашқаны үшін Нобель сыйлығымен марапатталды, ол кезде бактериялық ДНК репликациясының механизмі деп есептелді, бірақ бұл тәжірибеде ол pol III-нің нақты репликациялық машина екенін көрсетті. NEM төмен K концентрациялы қой және ешкінің қызыл қан жасушаларында оуабаинге сезімсіз Cl-ға тәуелді K шығынын белсендіреді. Бұл жаңалық 16 жылдан кейін KCC1 изоформасының cDNA-сымен трансфекцияланған адам эмбриональды жасушаларында K Cl котранспортын (KCC) молекулалық деңгейде анықтауға көмектесті. Содан бері NEM жануарлар әлемінің көптеген түрлерінің жасушаларында K Cl котранспортының мембранада болуын анықтау немесе өзгерту үшін кеңінен қолданылатын диагностикалық құрал болып табылады. Физиологиялық pH-та тиолдық мақсатты топты химиялық түрде анықтауға бірнеше рет жасалған сәтсіз әрекеттерге қарамастан, NEM ақуыз киназалары ішіндегі тиолдармен аддукттарды құрауы мүмкін, бұл киназалар KCC-ні тасымалдаушының С-терминалды доменіндегі белгілі бір серин және треонин қалдықтарында фосфорилдейді. Ақуыз фосфатазалары арқылы KCC-нің дефосфорилденуі KCC-нің белсендірілуіне әкеледі.
NEM blocks vesicular transport. In lysis buffers, 20 to 25 mM of NEM is used to inhibit de sumoylation of proteins for Western Blot analysis. NEM has also been used as an inhibitor of deubiquitinases. N Ethylmaleimide was used by Arthur Kornberg and colleagues to knock out DNA polymerase III in order to compare its activity to that of DNA polymerase I (pol III and I, respectively). Kornberg had been awarded the Nobel Prize for discovering pol I, then believed to be the mechanism of bacterial DNA replication, although in this experiment he showed that pol III was the actual replicative machinery. NEM activates ouabain insensitive Cl dependent K efflux in low K sheep and goat red blood cells. This discovery contributed to the molecular identification of K Cl cotransport (KCC) in human embryonic cells transfected by KCC1 isoform cDNA, 16 years later. Since then, NEM has been widely used as a diagnostic tool to uncover or manipulate the membrane presence of K Cl cotransport in cells of many species in the animal kingdom. Despite repeated unsuccessful attempts to identify chemically the target thiol group, at physiological pH, NEM may form adducts with thiols within protein kinases that phosphorylate KCC at specific serine and threonine residues primarily within the C terminal domain of the transporter. The ensuing dephosphorylation of KCC by protein phosphatases leads to activation of KCC.