N-этилмалеимид (NEM) – это органическое соединение, полученное из малеиновой кислоты. Оно содержит амидную функциональную группу, но, что более важно, является алкеном, реакционноспособным по отношению к тиолам, и широко используется для модификации остатков цистеина в белках и пептидах.
N Ethylmaleimide (NEM) is an organic compound that is derived from maleic acid. It contains the amide functional group, but more importantly it is an alkene that is reactive toward thiols and is commonly used to modify cysteine residues in proteins and peptides.
Органическая химия
NEM является акцептором Майкла в реакции Майкла, что означает, что он присоединяет нуклеофилы, такие как тиолы. Образующийся тиоэфир характеризуется прочной связью C-S, и реакция практически необратима. Реакция с тиолами протекает в диапазоне pH 6,5–7,5, при более щелочном pH NEM может реагировать с аминами или подвергаться гидролизу. NEM широко используется для изучения функциональной роли тиольных групп в энзимологии. NEM является необратимым ингибитором всех цистеиновых пептидаз, алкилирование происходит по тиольной группе в активном центре (см. схему).
NEM is a Michael acceptor in the Michael reaction, which means that it adds nucleophiles such as thiols. The resulting thioether features a strong C S bond and the reaction is virtually irreversible. Reaction with thiols occur in the pH range 6.5–7.5, NEM may react with amines or undergo hydrolysis at a more alkaline pH. NEM has been widely used to probe the functional role of thiol groups in enzymology. NEM is an irreversible inhibitor of all cysteine peptidases, with alkylation occurring at the active site thiol group (see schematic).
Качественные исследования
НЭМ блокирует везикулярный транспорт. В лизирующих буферах 20–25 мМ НЭМ используют для ингибирования десумоилирования белков при анализе методом Вестерн-блот. НЭМ также применяется как ингибитор деубиквитиназ. N-этилмалеимид был использован Артуром Корнбергом и его коллегами для инактивации ДНК-полимеразы III с целью сравнения её активности с активностью ДНК-полимеразы I (поли III и I соответственно). Корнберг был удостоен Нобелевской премии за открытие поли I, которая тогда считалась механизмом репликации бактериальной ДНК, хотя в этом эксперименте он показал, что поли III является фактическим репликационным аппаратом. НЭМ активирует нечувствительный к оуабаину K-зависимый Cl-эфлюкс в эритроцитах овец и коз с низким содержанием K. Это открытие способствовало молекулярной идентификации K-Cl котранспортера (KCC) в клетках эмбриона человека, трансфицированных кДНК изоформы KCC1, спустя 16 лет. С тех пор НЭМ широко используется в качестве диагностического инструмента для выявления или манипулирования мембранным присутствием K-Cl котранспортера в клетках многих видов животного мира. Несмотря на неоднократные безуспешные попытки химически идентифицировать целевую тиольную группу, при физиологическом pH НЭМ может образовывать аддукты с тиолами в протеинкиназах, которые фосфорилируют KCC в определенных сериновых и треониновых остатках, преимущественно в пределах C-концевого домена транспортера. Последующая дефосфорилирование KCC протеинфосфатазами приводит к активации KCC.
NEM blocks vesicular transport. In lysis buffers, 20 to 25 mM of NEM is used to inhibit de sumoylation of proteins for Western Blot analysis. NEM has also been used as an inhibitor of deubiquitinases. N Ethylmaleimide was used by Arthur Kornberg and colleagues to knock out DNA polymerase III in order to compare its activity to that of DNA polymerase I (pol III and I, respectively). Kornberg had been awarded the Nobel Prize for discovering pol I, then believed to be the mechanism of bacterial DNA replication, although in this experiment he showed that pol III was the actual replicative machinery. NEM activates ouabain insensitive Cl dependent K efflux in low K sheep and goat red blood cells. This discovery contributed to the molecular identification of K Cl cotransport (KCC) in human embryonic cells transfected by KCC1 isoform cDNA, 16 years later. Since then, NEM has been widely used as a diagnostic tool to uncover or manipulate the membrane presence of K Cl cotransport in cells of many species in the animal kingdom. Despite repeated unsuccessful attempts to identify chemically the target thiol group, at physiological pH, NEM may form adducts with thiols within protein kinases that phosphorylate KCC at specific serine and threonine residues primarily within the C terminal domain of the transporter. The ensuing dephosphorylation of KCC by protein phosphatases leads to activation of KCC.