Молекулалық биологияда G төрттік құрылымдар

Кіріспе

Молекулалық биологиядағы құрылым

Молекулалық биологияда G квадроплекстік екіншілік құрылымдар (G4) гуанинге бай тізбектер арқылы нуклеин қышқылдарында қалыптасады. Олар спираль тәрізді пішінде және бір, екі немесе төрт жіптен тұратын гуанин тетрадаларын қамтиды. Молекулалық формалар көбінесе хромосомалардың ұштарына жақын, жақсырақ айтқанда теломерлік аймақтарда, сондай-ақ микробтар мен омыртқалы жануарлардағы көптеген гендердің транскрипциялық реттеу аймақтарында табиғи түрде кездеседі. Төрт гуанин негізі Хугстин сутекті байланысы арқылы гуанин тетрады (G тетрады немесе G квартеті) деп аталатын төртбұрышты жазық құрылымды құрай алады, ал екі немесе одан көп гуанин тетрадалары (G трактарынан, гуаниннің үздіксіз тізбектерінен) бірінің үстіне бірін қойылып G квадроплексін құрайды. G квадроплексін қалыптастыру үшін орналасу және байланыс кездейсоқ емес және өте ерекше функционалдық мақсаттарға қызмет етеді. Төртбұрышты құрылым әр тетрада жұбының арасындағы орталық каналда орналасқан, әсіресе калийдің болуымен одан әрі тұрақтандырылады. Тетрадаларды құрайтын жіптердің немесе жіп бөліктерінің бағытына қарай құрылымдар параллель немесе антипараллель деп сипатталады. G квадроплекстік құрылымдар ДНҚ немесе РНҚ тізбек мотивтерінен есептеу арқылы болжануы мүмкін, бірақ олардың нақты құрылымдары мотивтердің ішінде де, арасында да өте әртүрлі болуы мүмкін, ал геномда олардың саны 100 000-нан асуы мүмкін. Олардың генетикалық процестердегі қызметі – теломерлер, гендерді реттеу және функционалдық геномика салаларындағы белсенді зерттеулердің нысаны болып табылады.

Тарих

Гуаниннің жоғары мөлшері бар құрылымдарды анықтау 1960-шы жылдардың басында гуанинмен байланысты гель тәрізді заттарды анықтау арқылы көзге түсті. Нақтырақ айтқанда, бұл зерттеу гуаниннің жоғары ассоциациясы бар төрт тізбекті ДНК құрылымын егжей-тегжейлі сипаттады, ол кейіннен 1980-ші жылдары ДНК-ның эукариоттық теломерлік аймақтарында табылды. G квадроплекс құрылымын ашудың маңыздылығы «Егер G квадроплекстер in vitro жағдайында оңай түзілсе, табиғат оларды in vivo қолданудың жолын тапқан болар» деген тұжырымдама арқылы көрсетілді. Химия саласындағы Нобель сыйлығының лауреаты (1982) Аарон Клуг. Адам, шимпанзе, егеуқұйрық және еліктердің гендерінің промоторларындағы ықтимал G квадроплекстерін (pG4) құрайтын ДНК тізбектерін анықтаған кең ауқымды геномдық талдаудан кейін G квадроплекстерінің in vivo функциясына қызығушылық арта түсті, бұл мәліметтер 2007 жылдың сәуірінде Кентукки штатының Луисвилл қаласында өткен бірінші халықаралық G квадроплекс конференциясында ұсынылды. Содан кейін, осы ДНК құрылымдарына тән шағын молекулалар жасушаларда жинақталатын белгілі бір ДНК геликазаларын анықтау мүмкін болды.

Геномның құрылымы мен функционалдық рөлі

Адам геномын тізбектеуден кейін, төрттік құрылымдарға айналу мүмкіндігі бар гуанинге бай көптеген тізбектер анықталды. Жасуша түріне және жасуша циклына байланысты, хроматиндегі ДНК-мен байланысатын ақуыздар, гистон ақуыздарының айналасына тығыз оралған ДНК-дан тұратын және басқа да қоршаған орта факторлары мен стрестер төрттік құрылымдардың динамикалық қалыптасуына әсер етеді. Мысалы, молекулалық тығыздықтың термодинамикасын сандық бағалау, антипараллельді g төрттік құрылымын молекулалық тығыздықпен тұрақтандыратынын көрсетеді. Бұл әсер ДНК-ның гидратациялануының өзгеруі және оның Hoogsteen базалық жұп байланысына тигізетін әсері арқылы жүзеге асатын сияқты. Бұл төрттік құрылымдар хромосома ұштарында оңай пайда болады. Сонымен қатар, РНК тізбектерінде транскрипция кезінде өзара ерекшеленетін шаштық тізбек немесе G төрттік құрылымдарды қалыптастыруға бейімділігі бар g төрттік құрылымның пайда болу ықтималдығы шаштық тізбекті қалыптастыратын тізбектің орналасуына тікелей байланысты. Өйткені жөндеу ферменттері сызықтық хромосомалардың ұштарын зақымдалған ДНҚ ретінде таниды және оларды жасуша үшін зиянды салдарларға алып келеді, сондықтан сызықтық хромосомалардың ұштарында нақты сигнал беру және қатаң реттеу қажет. Теломерлер осы сигналды беруге арналған. Гуанинге бай және g төрттік құрылымдарын қалыптастыруға бейім теломерлер хромосомалардың терминалдық ұштарында орналасқан және осы осал ұштарды тұрақсыздықтан қорғау арқылы геномның тұтастығын сақтауға көмектеседі. Бұл теломерлік аймақтар ұзақ CCCTAA:TTAGGG қайталануларынан тұрады. Қайталанулар 10-дан 50-ге дейінгі бір жіпті TTAGGG қайталануларының 3’ ұшымен аяқталады. Гетеродимерлі рибонуклеопротеин ферменті теломераза ДНК тізбектерінің 3’ ұшына TTAGGG қайталануларын қосады. Осы 3’ ұшындағы ұзындықта G-ге бай артық бөліктер, егер артық бөліктер төрт TTAGGG қайталануынан ұзын болса, G төрттік құрылымдары сияқты екіншілік құрылымдарды қалыптастыра алады. Бұл құрылымдардың болуы теломераза кешенінің теломерлерді ұзартуына кедерес жасайды.

Following sequencing of the human genome, many guanine rich sequences that had the potential to form quadruplexes were discovered. Depending on cell type and cell cycle, mediating factors such as DNA binding proteins on chromatin, composed of DNA tightly wound around histone proteins, and other environmental conditions and stresses affect the dynamic formation of quadruplexes. For instance, quantitative assessments of the thermodynamics of molecular crowding indicate that the antiparallel g quadruplex is stabilized by molecular crowding. This effect seems to be mediated by alteration of the hydration of the DNA and its effect on Hoogsteen base pair bonding. These quadruplexes seemed to readily occur at the ends of chromosome. In addition, the propensity of g quadruplex formation during transcription in RNA sequences with the potential to form mutually exclusive hairpin or G quadruplex structures depends heavily on the position of the hairpin forming sequence. Because repair enzymes would naturally recognize ends of linear chromosomes as damaged DNA and would process them as such to harmful effect for the cell, clear signaling and tight regulation is needed at the ends of linear chromosomes. Telomeres function to provide this signaling. Telomeres, rich in guanine and with a propensity to form g quadruplexes, are located at the terminal ends of chromosomes and help maintain genome integrity by protecting these vulnerable terminal ends from instability. These telomeric regions are characterized by long regions of double stranded CCCTAA:TTAGGG repeats. The repeats end with a 3’ protrusion of between 10 and 50 single stranded TTAGGG repeats. The heterodimeric complex ribonucleoprotein enzyme telomerase adds TTAGGG repeats at the 3’ end of DNA strands. At these 3’ end protrusions, the G rich overhang can form secondary structures such as G quadruplexes if the overhang is longer than four TTAGGG repeats. The presence of these structures prevent telomere elongation by the telomerase complex.

Теломерлік төртбұрыштар

Теломерлік қайталанулар түрлі организмдерде in vitro осы төрттік құрылымдарды құрайтыны көрсетілді, содан кейін олар in vivo да құрайтыны анықталды. Адамның теломерлік қайталануы (барлық омыртқалы жануарлар үшін ортақ) (TTAGGG) тізбегінің көптеген қайталануларынан тұрады, ал осы құрылымнан түзілген төрттік құрылымдар 5–8 нм көлемдегі дөңгелек тәрізді құрылымдар түрінде кездеседі және ЯМР, ЭЖМ және рентгендік кристалл құрылымдарын анықтау арқылы жақсы зерттелген. Теломерлердегі осы төрттік құрылымдардың пайда болуы теломерлердің ұзындығын сақтауға жауапты және барлық қатерлі ісіктердің шамамен 85%-ына қатысы бар теломераза ферментінің активтілігін төмендетеді. Бұл, теломестатин сияқты, жаңа дәрілерді іздестірудің маңызды нысаны болып табылады.

Теломерлік емес төртбұрыштар

Төртбұрышты түйіндер теломерден басқа жерлерде де кездеседі. Адам, шимпанзе, егесік және тышқан геномдарын талдау, теломерлік емес аймақтарда G квадроплексін (pG4) құрайтын потенциалды тізбектердің көп санын көрсетті. Көптеген теломерлік емес G квадроплекстер гендердің промоторларында табылды және түрлер арасында сақталды. Бұл зерттеулер G квадроплексінің гендік реттеуге қатысуын болжаса да, барлық pG4 in vivo жағдайында қалыптасатыны күмәнді. Протоонкоген c-myc геннің белсенділігі үшін маңызды нуклеазаға сезімтал аймақта төртбұрышты түйін құрайды. Промоторлық аймақтарында G квадроплексін құрайтын басқа гендерге тауықтың β-глобин гені, адамның убиквитин лигазасы RFP2, сондай-ақ протоонкогендер c-kit, bcl-2, VEGF, H-ras және N-ras жатады. Төртбұрышты бүктеу ережесіне негізделген геномдық зерттеулер адам геномында 376 000 болжамды төртбұрышты реттілікті (PQS) анықтады, бірақ олардың барлығы in vivo қалыптаспауы мүмкін. Ұқсас зерттеулер прокариоттарда, атап айтқанда E. coli бактериясында да G квадроплексін анықтады. Төртбұрышты түйіндер гендік белсенділікке жоғарылату немесе төмендету арқылы әсер етуінің бірнеше мүмкін үлгілері бар. Бір үлгі төменде көрсетілген: G квадроплексінің промоторда немесе оның жанында қалыптасуы геннің транскрипциясын тоқтатып, оны деактивациялайды. Басқа үлгіде кодталмаған ДНҚ тізбегінде қалыптасқан төртбұрышты түйін кодталатын ДНҚ-ның ашық конформациясын сақтап, тиісті геннің экспрессиясын күшейтеді.

Функция

Иммуноглобулиннің ауыр тізбегін ауыстыруда квадроплекс түзілудің қатысы бар деген болжам бар. DEAH/RHA геликазасы, DHX36, негізгі G квадроплекс резольвазасы ретінде анықталды. 2009 жылы метастазды тежеуші NM23H2 (сондай-ақ NME2 деп те аталады) ақуызының c myc генінің промоторындағы G квадроплексімен тікелей өзара әрекеттесетіні және c myc транскрипциясын реттейтіні анықталды. Соңғы кезде NM23H2 адам теломеразасы (hTERT) генінің промоторындағы G квадроплексімен өзара әрекеттесетіні және hTERT экспрессиясын реттейтіні хабарланды. 2019 жылы TRF2 ChIP-seq арқылы теломераға байланысатын фактор 2 (TRF2 немесе TERF2) адам геномындағы мыңдаған теломералық емес G квадроплекстермен байланысатыны көрсетілді. Квадроплекстердің оң және теріс транскрипциялық реттелуіне, соның ішінде hTERT сияқты гендердің эпигенетикалық реттелуіне қатысты көптеген зерттеулер бар. Аударма бақылауындағы квадроплекс құрылымдарының рөлі толыққанды зерттелмеген. Адам жасушаларындағы G квадроплекс құрылымдарын тікелей визуализациялау, сондай-ақ G квадроплекске байланысқан РНК геликазасының кокристалдық құрылымы, олардың жасуша биологиясы үшін маңызды екенін растады. Теломералардың көбейісі мен функциясындағы квадроплекстердің ықтимал оң және теріс рөлі әлі де даулы. T-тұйықтары және G квадроплекстері – теломералардың ұштарын қорғайтын және олардың ұзындығын реттейтін екі үшіншілік ДНК құрылымы.

G-квадруплекс құрылымдарын қалыптастыру арқылы геномды реттеу

Көптеген геномдық реттеу процестері G квадроплекс құрылымдарының қалыптасуымен байланысты, себебі олар апридиникалық/апиримидиникалық сайттар (АП сайттары) деп аталатын ДНҚ зақымдарын жөндеуде маңызды рөл атқарады. АП сайттарды анықтаудың жаңа әдісі әзірленді – АП-seq, ол АП сайттарының зақымдануы айқын байқалған геном аймақтарын белгілеу үшін биотиндік белгісі бар альдегидтік реакцияға түсетін зондты (АРП) пайдаланады. Тағы бір геномдық карталау әдісі – ChIP секвенциялау, АП сайттарындағы зақымдануды және оны жөндеуге жауапты фермент – АП эндонуклеаза 1 (APE1) анықтау үшін қолданылды. Бұл екі геномдық карталау әдісі, ChIP секвенциялау және ARP, АП сайттарының зақымдануының кездейсоқ емес екенін көрсетті. АП сайттарының зақымдануы геномның белгілі бір аймақтарында, нақтырақ айтқанда, белсенді промоторлар мен энхансерлердің маркелері бар жерлерде жиірек кездеседі, олардың кейбіреулері өкпе аденокарциномасы және колоректальді қатерлі ісікке жауапты аймақтармен байланысты. АП сайттарының зақымдануы геномның PQS аймақтарында басым болып табылды, онда G квадроплекс құрылымдарының қалыптасуы ДНҚ жөндеу процесі – базалық экзициялық жөндеу (BER) арқылы реттеледі және күшейтіледі. Бұл G квадроплекс құрылымдары ДНҚ промоторлық аймақтарында суперспиральділік арқылы қалыптасады, ол ДНҚ-ның қос спиральді құрылымын айналдырып, гуанинге бай аймақтарда G квадроплекс құрылымдарын жасайды. BER жолы ДНҚ базалық зақымдануын, әсіресе окисденуді анықтағанда белсендіріледі, онда 8-оксогуанин ДНҚ гликозилаза 1 (OGG1), APE1 және G квадроплексі сияқты құрылымдар оны жөндеуде маңызды рөл атқарады. Бұл ферменттер BER процесіне қатысып, 7,8-дигидро-8-оксогуанин (8-оксоG) сияқты ДНҚ зақымдарын жөндеуге көмектеседі, ол гуанин негіздеріне окисдену стресінің әсерінен пайда болады.

G4 түзілуінде эндогендік тотықталған ДНК базалық зақымданудың рөлі

Гуанин (G) негіздері G-квадруплексінде ең төменгі тотығу-тоқайту потенциалына ие, сондықтан 8-оксогуанин (8-оксоG) түзілуге көбірек бейім, ол геномдағы эндогендік тотыққан ДНК негіздерінің зақымдануы болып табылады. Гуаниннің басқа нуклеотидтік негіздерге қарағанда төмен электронды тотығу потенциалы болғандықтан, 8-оксо-2'-дезоксигуанозин (8-оксо dG) ДНК тотығуының негізгі өнімі болып табылады. Оның концентрациясы жасуша ішіндегі тотығу стресін өлшеу үшін қолданылады. ДНК тотығу зақымдануына ұшырағанда, иондаушы сәулеленуден кейін гуаниннің құрылымдық өзгеруі энол түрін, 8-OH Gua-ны тудырады. Бұл тотығу өнімі бастапқы зақымдалған гуанин, 8-оксо Gua-дан таутомерлік ауысу арқылы пайда болады және құрылымдық өзгерістерге алып келетін ДНК зақымдануын көрсетеді. Бұл форма OGG1 базалық экзизиялық жөндеу (BER) ферментіне APE1 көмегімен тотығу зақымдануын байланыстырып, жоюға мүмкіндік береді, нәтижесінде AP орны пайда болады. 8-оксо dG пайда болғанда OGG1-ді инактивациялай алады, осылайша гуаниннің тотығуынан туындаған ДНК зақымдануын жөндеуге кедергі келтіреді. Адамның тимидинкиназа геніне 8-оксо dG енгізілген кезде, егер 8-оксо dG бақыланбаса және BER арқылы жөнделмесе, жиі мутацияларға және соңында канцерогенезге әкелуі мүмкін екені анықталды. Бұл циклдік процесс төрт негізді бір-біріне жақын орналастырады, олар Hoogsteen негіздерінің жұптасуымен байланысты болады. Осы кезеңнен кейін APE1 хроматиндегі көптеген лизин қалдықтарымен ацетилденіп, ацетилденген APE1 (AcAPE1) түзеді. AcAPE1 да өте маңызды, себебі ол APE1-дің тізбектен ажырауын кешіктіру арқылы ұзақ уақыт бойы байланысуына мүмкіндік береді, бұл жөндеу процесін тиімдірек етеді. AcAPE1 деацетилденуі осы транскрипциялық факторлардың (TF) жүктелуіне ықпал етеді, онда APE1 G-квадруплекс құрылымдарынан бөлінеді. Зерттеуде жасушада APE1 және AcAPE1 деңгейі төмендетілген кезде G-квадруплекс құрылымдарының қалыптасуы тежелді, бұл осы құрылымдардың қалыптасуы үшін APE1-дің маңыздылығын көрсетеді. Алайда, барлық G-квадруплекс құрылымдарының қалыптасуы үшін APE1 қажет емес, шын мәнінде кейбіреулері оның болмауында үлкен G-квадруплекс құрылымдарын құрайды.

Guanine (G) bases in G quadruplex have the lowest redox potential causing it to be more susceptible to the formation of 8 oxoguanine (8 oxoG), an endogenous oxidized DNA base damage in the genome. Due to Guanine having a lower electron reduction potential than the other nucleotides bases,8 oxo 2' deoxyguanosine (8 oxo dG), is a known major product of DNA oxidation. Its concentration is used as a measurement of oxidative stress within a cell. When DNA undergoes oxidative damage, a possible structural change in guanine, after ionizing radiation, gives rise to an enol form, 8 OH Gua. This oxidative product is formed through a tautomeric shift from the original damage guanine, 8 oxo Gua, and represents DNA damage that causes changes in the structure. This form allows for the base excision repair (BER) enzyme OGG1 to bind and remove the oxidative damage with the help of APE1, resulting in an AP site. When produced, 8 oxo dG, has the ability to inactivate OGG1, thus preventing the repair of DNA damage caused by the oxidation of guanine. Upon insertion of 8 oxo dG into thymidine kinase gene of humans, it was determine that if 8 oxo dG was left unchecked and not repaired by BER, it can lead to frequent mutations and eventually carcinogenesis. This looping process brings four bases in close proximity that will be held together by Hoogsteen base pairing. After this stage the APE1 gets acetylated by multiple lysine residues on the chromatin, forming acetylated APE1 (AcAPE1). AcAPE1 is also very important since it allows APE1 to bind for longer periods of time by delay of its dissociation from the sequence, allowing the repair process to be more efficient. Deacetylation of AcAPE1 is the driving force behind the loading of these TFs, where APE1 dissociates from the G quadruplex structures. When a study downregulated the presence of APE1 and AcAPE1 in the cell, the formation of G quadruplex structures was inhibited, which proves the importance of APE1 for the formation of these structures. However, not all G quadruplex structures require APE1 for formation, in fact some of them formed greater G quadruplex structures in its absence.

Жетекші өңірлер

Қатерлі ісіктердің теломерлік аймақтарындағы G квадроплекстерінің қатысуымен қатар, G квадроплекс құрылымдары әртүрлі адам протоонкогендерінің промоторлық аймақтарында анықталды. Бұл онкогендердің промотор аймақтарында ең көп кездесетін құрылымдар параллель тізбекті G квадроплексті ДНК құрылымдары болып табылады. Бұл онкогендердің кейбіреулері c KIT, PDGF A, c Myc және VEGF-ті қамтиды, бұл осы екінші құрылымның қатерлі ісіктердің өсуі мен дамуындағы маңыздылығын көрсетеді. Г-квадруплекс құрылымының қалыптасуы онкогендердің әртүрлі промоторлық аймақтарында белгілі бір дәрежеде өзгереді, бірақ бұл құрылымдардың тұрақты тұрақтандырылуы қатерлі ісік дамуында анықталды. Қазіргі терапиялық зерттеулер G квадроплекс құрылымдарының тұрақтандырылуын реттеуге белсенді түрде бағытталған, бұл ретте клеткалардың ретсіз өсуі мен бөлінуін тоқтатуға мүмкіндік береді. Бір гендік аймақ, c Myc жолы, c Myc ақуыз өнімінің реттелуінде маңызды рөл атқарады. Бұл өнім c Myc ақуызы апоптоз процесінде, жасушалардың өсуі мен дамуында және адам теломеразасының кері транскриптазасының транскрипциялық бақылауында қатысады. Myc промоторы G квадроплексінің NM23H2-мен өзара әрекеттесуі 2009 жылы қатерлі ісік жасушаларында Myc-ті реттейтіні көрсетілді.

Тағы бір гендік жол ВЕГФ генімен, қан тамырларын өсіру факторымен байланысты, ол ангиогенез процесіне, яғни жаңа қан тамырларының қалыптасуына қатысады. Зерттеулер ВЕГФ генінің промотор аймағындағы полипуриндік учаскедегі молекулалық G квадроплекс құрылымының қалыптасуын көрсетті. G квадроплекс функциясының in vivo рөліне қатысты жақындағы зерттеулер G квадроплекс құрылымдарының тұрақтандырылуы ВЕГФ генінің транскрипциясын реттейтінін, бұл жолдағы транскрипция факторларын тежейтінін көрсетті. Молекулалық G квадроплекс құрылымдары негізінен осы жолдың промотор аймағындағы көп мөлшерде гуанин тізбегі арқылы қалыптасады. Циклинге тәуелді жасуша циклының бақылау нүктесі кинеза ингибиторы 1 CDKN1A (p21 деп те аталады) генінде G квадроплекс промоторы бар. Бұл G квадроплекстің TRF2-мен (TERF2 деп те аталады) өзара әрекеттесуі p21 эпигенетикалық реттеуіне әкелді, бұл G квадроплекстің 360A байланыстыру лиганды арқылы тексерілді. Гипоксияға әкелетін 1ɑ факторы, HIF 1ɑ, гипоксияның бар болуы кезінде ангиогенез процесін бастау үшін гипоксияға жауап беретін элементпен, HRE-мен байланысу арқылы қатерлі ісікке сигнал беруге қатысады. Осы гендік жолды зерттеу барысында полипурин және полипиримидин аймағы осы геннің транскрипциясына және молекулалық G квадроплекс құрылымының пайда болуына мүмкіндік береді. Алайда, G квадроплексінің түзілуі осы геннің экспрессиясын оң немесе теріс бағытта реттей ме, жоқ па, оны анықтау үшін қосымша зерттеулер қажет. Oncogene c kit белгілі бір қатерлі ісіктерде экспрессия деңгейі жоғары екендігі анықталған RTK кодтайтын жолды қамтиды. Бұл промотор аймағының гуанинді бай тізбектері әр түрлі квадроплекстерді қалыптастыру қабілетін көрсетті. Қазіргі уақытта бұл жол бойынша жүргізіліп жатқан зерттеулер цитогендік жолдағы осы нақты төрт бұрышты құрылымның биологиялық қызметін анықтауға бағытталған, ал бұл төрт бұрышты рет әртүрлі түрлерде байқалды. PDGF A, тромбоциттерден алынған өсу факторына қатысы бар тағы бір онкогендік жол жарақаттың сауығу процесін қамтиды және митогендік өсу факторлары ретінде жұмыс істейді. PDGF экспрессиясының жоғары деңгейі жасушалардың өсуі мен қатерлі ісіктің өсуімен байланысты. PDGF A промотор аймағында гуанинге бай тізбектің болуы молекулааралық параллельді G квадроплекс құрылымдарын қалыптастыру қабілетін көрсетті және PDGF A транскрипциялық реттеуде рөл атқарады деп болжанады. Алайда, зерттеулер TMPyP4 пен осы промотор тізбектерінің өзара әрекеттесуіне байланысты осы аймақта G квадроплекс құрылымдарының бар екендігін анықтады.

Another gene pathway deals with the VEGF gene, Vascular Endothelial Growth Factor, which remains involved in the process of angiogenesis or the formation of new blood vessels. The formation of an intramolecular G quadruplex structure has been shown through studies on the polypurine tract of the promoter region of the VEGF gene. Through recent research on the role of G quadruplex function in vivo, the stabilization of G quadruplex structures was shown to regulate VEGF gene transcription, with inhibition of transcription factors in this pathway. The intramolecular G quadruplex structures are formed mostly through the abundant guanine sequence in the promoter region of this specific pathway. The cyclin dependent cell cycle checkpoint kinase inhibitor 1 CDKN1A (also known as p21) gene harbours promoter G quadruplex. Interaction of this G quadruplex with TRF2 (also known as TERF2) resulted in epigenetic regulation of p21, which was tested using the G quadruplex binding ligand 360A. Hypoxia inducible factor 1ɑ, HIF 1ɑ, remains involved in cancer signaling through its binding to Hypoxia Response Element, HRE, in the presence of hypoxia to begin the process of angiogenesis. Through recent research into this specific gene pathway, the polypurine and polypyrimidine region allows for the transcription of this specific gene and the formation of an intramolecular G quadruplex structure. However, more research is necessary to determine whether the formation of G quadruplex regulates the expression of this gene in a positive or negative manner. The c kit oncogene deals with a pathway that encodes an RTK, which was shown to have elevated expression levels in certain types of cancer. The rich guanine sequence of this promoter region has shown the ability to form a variety of quadruplexes. Current research on this pathway is focusing on discovering the biological function of this specific quadruplex formation on the c kit pathway, while this quadruplex sequence has been noticed in various species. Another oncogene pathway involving PDGF A, platelet derived growth factor, involves the process of wound healing and function as mitogenic growth factors for cells. High levels of expression of PDGF have been associated with increased cell growth and cancer. The presence of a guanine rich sequence in the promoter region of PDGF A has exhibited the ability to form intramolecular parallel G quadruplex structures and remains suggested to play a role in transcriptional regulation of PDGF A. However, research has also identified the presence of G quadruplex structures within this region due to the interaction of TMPyP4 with this promoter sequence.

Емдеу құралдары

Теломерлер әдетте G квадроплекстерден тұрады және терапиялық зерттеулер мен жаңалықтар үшін маңызды нысана болып табылады. Бұл кешендер порфирин сақиналарымен жоғары сәйкес келеді, осылайша оларды тиімді қатерлі ісікке қарсы агенттер етеді. Дегенмен, TMPyP4-тің қолданылуы оның қатерлі жасуша теломерлеріне және қалыпты екі тізбекті ДНК-ға (dsDNA) қатысты селективті еместігіне байланысты шектеулі. Бұл мәселені шешу үшін TMPyP4 аналогы – 5Me синтезделді, ол тек G квадроплекс ДНК-ны нысаналайды және TMPyP4-ке қарағанда қатерлі ісік өсуін тиімдірек тежейді. Лигандтарды жобалау және дамыту, G квадроплекстердің көптігі және олардың конформациялық айырмашылықтарының салдарынан, терапиялық реагенттерді зерттеудің маңызды саласы болып қала береді. Квиндолин туындысын қамтитын лигандтың бір түрі – SYUIQ 05, G квадроплекстердің промоторлық аймақтарда тұрақтандырылуын пайдаланып, c Myc ақуыз өнімінің және адам теломеразасының кері транскриптазасының (hTERT) өндірісін тежеуге мүмкіндік береді. Бұл аймақты нысанаға алудың негізгі жолы теломеразаның ұзартылмауына алып келеді, нәтижесінде жасуша дамуы тоқтатылады. Қатерлі ісікке қарсы белсенділігі жоғары бір генді анықтау үшін қосымша зерттеулер қажет. TMPyP4, катиондық порфирин, Myc-ты басуға көмектесетін жақсы танымал G4 байланыстыратын лиганд. TMPyP4-тің G4-ке байланысу жолы MM41 сияқты, сақинаның сыртқы G квартетіне және G4-тің иілгіш тізбектеріне қосылатын бүйірлік тізбектерге сәйкес келеді. G квадроплекстерге байланысатын лигандтарды жобалау кезінде, лигандтар параллель бүктелінген G квадроплекстерге жоғары сәйкес келеді. Кіші бүйірлік тізбектері бар лигандтар төртбұрыштыға жақсырақ байланысады, себебі кіші лигандтардың электрондық тығыздығы жоғарырақ. Сонымен қатар, кіші бүйірлік тізбектері бар лигандтардың сутекті байланыстары қысқарақ және демек, күштірек. Орталық хромофорының айналасында айнала алатын жылдам бүйірлік тізбектері бар лигандтар, G квадроплекстермен күштірек байланысады, өйткені G4 иілгіш тізбектерінің конформациясы мен лигандтың бүйірлік тізбектері арасында үйлесімділік болуы мүмкін.

Telomeres are generally made up of G quadruplexes and remain important targets for therapeutic research and discoveries. These complexes have a high affinity for porphyrin rings which makes them effective anticancer agents. However, TMPyP4 has been limited for used due to its non selectivity toward cancer cell telomeres and normal double stranded DNA (dsDNA). To address this issue analog of TMPyP4, it was synthesized known as 5Me which targets only G quadruplex DNA which inhibits cancer growth more effectively than TMPyP4. Ligand design and development remains an important field of research into therapeutic reagents due to the abundance of G quadruplexes and their multiple conformational differences. One type of ligand involving a Quindoline derivative, SYUIQ 05, utilizes the stabilization of G quadruplexes in promoter regions to inhibit the production of both the c Myc protein product and the human telomerase reverse transcriptase (hTERT). This main pathway of targeting this region results in the lack of telomerase elongation, leading to arrested cell development. Further research remains necessary for the discovery of a single gene target to minimize unwanted reactivity with more efficient antitumor activity. TMPyP4, a cationic porphyrin, is a more well known G4 binding ligand that helps to repress c Myc. The way in which TMPyP4 binds to G4's is similar to MM41, with the ring stacking onto the external G quartet and side chains associating to the loops of G4's. When designing ligands to be bound to G quadruplexes, the ligands have a higher affinity for parallel folded G quadruplexes. It has been found that ligands with smaller side chains bind better to the quadruplex because smaller ligands have more concentrated electron density. Furthermore, the hydrogen bonds of ligands with smaller side chains are shorter and therefore stronger. Ligands with mobile side chains, ones that are able to rotate around its center chromophore, associate more strongly to G quadruplexes because conformation of the G4 loops and the ligand side chains can align.

Төртбұрышты болжау әдістері

Төртбұрышты құрауға қабілетті тізбектерді анықтау және болжау олардың атқаратын рөлін одан әрі түсіну үшін маңызды құрал болып табылады. Әдетте, төртбұрышты құрайтын ықтимал тізбектерді іздеу үшін қарапайым үлгіге сәйкестік пайдаланылады: d(G3+N1 7G3+N1 7G3+N1 7G3+), мұнда N – кез келген нуклеотидтік база (гуанин қоса алғанда). Бұл ереже онлайн алгоритмдерде кеңінен қолданылады. Бұл қағида G төртбұрыштың қалыптасуын тиімді анықтаса да, триплекс қалыптасуына және C тізбегінің i мотивіне қабілетті, толық емес гомопуриндік айна қайталанулардың бір бөлігін де анықтайды. Сонымен қатар, бұл тізбектер төртбұрышты құрылымдардың қалыптасуында аралық ретінде болатын, жылғақ және бүктемелі құрылымдарды құруға да қабілетті. Бір зерттеуде толық геномдық тізбектері бар эуметазоидтарда осы мотивтердің бір негіз жұбына шаққандағы санының (яғни жиілігі) жылдам артқаны анықталды. Бұл тізбектер В емес құрылымдардың қалыптасуын басуға қабілетті жүйелердің эволюциясы арқылы оң таңдауға ұшырауы мүмкін екенін көрсетеді. Соңғы кезде G төртбұрышты құрау тізбектерін анықтау үшін жетілдірілген веб-құралдар жасалды, оның ішінде жылжымалы терезе әдісіне негізделген, пайдаланушыға ыңғайлы және ашық қолжетімді G4Hunter нұсқасы немесе машиналық оқыту алгоритміне негізделген G4RNA Screener.

G-квадруплекстерді зерттеу әдістері

G квадроплекстерін анықтау үшін бірнеше тәжірибелік әдістер әзірленді. Бұл әдістерді жалпы екі санатқа бөлуге болады: биофизикалық және биохимиялық әдістер.

Биохимиялық әдістер

Биохимиялық әдістер ұзақ тізбек контекстінде G-квадроплекстің қалыптасуын зерттеу үшін қолданылды. ДНК полимераза тоқтату әсерінде Г-квадроплекс ДНК матрицасында кедергі ретінде әрекет ете алады және полимеразаның тоқтауына, соның салдарынан праймердің кеңеюінің тоқтауына себеп болады. Диметил сульфаты (DMS) және одан кейін пиперидинмен кесу әсері G-квадроплекстің қалыптасуы DMS-тің N7 гуанинге метилдеуін шектеуге мүмкіндік береді, нәтижесінде пиперидинмен кесуден кейін ДНК-ның G-квадроплекс аймағында қорғаныс үлгісі байқалады.

Биофизикалық әдістер

G төртбұрышты құрылымының топологиясын белгілі бір толқын ұзындықтарындағы оң немесе теріс дөңгелек дихроизм (CD) сигналдарын бақылау арқылы анықтауға болады. Параллель G квадроплекстерде тиісінше 240 және 262 нм-де теріс және оң CD сигналдары байқалады, ал антипараллель G квадроплекстерде бұл сигналдар тиісінше 262 және 295 нм-де орналасады. G квадроплексінің қалыптасуын тексеру үшін CD эксперименттерін G квадроплексін тұрақтандырмайтын (Li+) және G квадроплексін тұрақтандыратын жағдайларда (мысалы, K+ немесе G квадроплекс лигандтарымен) және алыс ультракөк сәуле аймағына (180–230 нм) қарай сканерлеу қажет. Сол сияқты, G төртбұрышты құрылымының термотұрақтылығын 295 нм-дегі ультракөк сәуле сигналын бақылау арқылы анықтауға болады. G квадроплексі балқығанда 295 нм-дегі ультракөк сәуле сіңірілуі төмендейді, бұл G квадроплекс құрылымының ерекше белгісі болып табылатын гипохромдық ығысуға алып келеді. G квадроплекстерін анықтаудың тағы бір тәсілі – нанопораға негізделген әдістерді қолдану. Алдымен, биологиялық нанопоралар G квадроплекстерін мөлшері бойынша сүзу және G квадроплекс пен белоктың наноқуысы арасындағы нақты өзара әрекеттесу негізінде анықтай алатыны көрсетілді. Жаңа тәсіл қатты күйдегі нанопораларды және ДНҚ нанотехнологиясын біріктіре отырып, G квадроплекстерін маркерсіз анықтауға, оларды қос спиральді ДНҚ-да картаға түсіруге және G квадроплексінің қалыптасуын бақылауға мүмкіндік береді.

Неврологиялық аурулардағы рөлі

G квадроплекстер неврологиялық ауруларға екі негізгі механизм арқылы қатысты екені анықталды. Біріншісі – гендердегі G қайталауларының ұзаруы, бұл ауруды тікелей тудыратын G квадроплекс құрылымдарының пайда болуына әкеледі, мысалы, C9orf72 гені және амиотрофиялық бүйірлік склероз (ALS) немесе фронтотемпоральді деменция (FTD) жағдайында. Екінші механизм – G квадроплексіне байланысқан ақуыздардың экспрессиясына әсер ететін мутациялар арқылы, бұл X-фрагильді 1 (FMR1) генінде және X-фрагильді синдромында көрінеді. C9orf72 гені мидың барлық бөлігінде, нейрон цитоплазмасында және пресинаптикалық терминалдарда табылған C9orf72 ақуызын кодтайды. C9orf72 генінің мутациялары FTD және ALS дамуымен байланысты. Бұл екі аурудың C9orf72 генінің 1-інтронындағы GGGGCC (G4C2) қайталауларымен себеп-салдарлық байланысы бар. Денсаулыған адамдарда әдетте 2-ден 8-ге дейін G4C2 қайталауы болады, ал FTD немесе ALS бар адамдарда 500-ден бірнеше мыңға дейін G4C2 қайталауы кездеседі. Бұл қайталаулардың транскрипцияланған РНК тұрақты G квадроплекстерін құрайтыны көрсетілді, сонымен қатар ДНК-дағы G4C2 қайталаулары аралас параллель-антипараллель G квадроплекс құрылымдарын құруға қабілетті екені анықталды. G4C2 қайталауларын қамтитын бұл РНК транскрипттері нуклеолин сияқты әртүрлі ақуыздармен байланысып, оларды бөліп шығарады. Нуклеолин ядродағы рибосомалардың синтезі мен жетілуіне қатысады, ал мутацияланған РНК транскрипттерімен нуклеолиннің бөлінуі нуклеолярлық функцияны және рибосомалық РНК синтезін бұзады. Х-фрагильді ақыл-ой кемістігі ақуызы (FMRP) – FMR1 генімен кодталатын және нейрондардағы G квадроплекс екінші құрылымдарына байланысып, синапты пластикалық процеске қатысатын кеңінен экспрессияланатын ақуыз. FMRP аударманың теріс реттеушісі болып табылады, оның байланысуы мРНК транскрипттеріндегі G квадроплекс құрылымдарын тұрақтандырады, нейрон дендритіндегі мРНК рибосомалық ұзартылуын тежейді және транскрипт экспрессиясының уақытын бақылайды. Бұл геннің мутациялары Х-фрагильді синдромының, аутизмнің және басқа да неврологиялық аурулардың дамуына себеп болуы мүмкін. Атап айтқанда, Х-фрагильді синдромы FMR1 генінің 13-экзонындағы 50-ден 200-ден астам CGG қайталауының көбеюінен туындайды. Бұл қайталаудың ұзаруы ДНК метилирленуін және FMR1-нің басқа эпигенетикалық гетерохроматиндік модификацияларын ынталандырады, бұл геннің транскрипциясына кедергі келтіріп, FMRP деңгейінің патологиялық түрде төмендеуіне әкеледі.

G quadruplexes have been implicated in neurological disorders through two main mechanisms. The first is through expansions of G repeats within genes that lead to the formation of G quadruplex structures that directly cause disease, as is the case with the C9orf72 gene and amyotrophic lateral sclerosis (ALS) or frontotemporal dementia (FTD). The second mechanism is through mutations that affect the expression of G quadruplex binding proteins, as seen in the fragile X mental retardation gene 1 (FMR1) gene and Fragile X Syndrome. The C9orf72 gene codes for the protein C9orf72 which is found throughout the brain in neuronal cytoplasm and at presynaptic terminals. Mutations of the C9orf72 gene have been linked to the development of FTD and ALS. These two diseases have a causal relationship to GGGGCC (G4C2) repeats within the 1st intron of C9orf72 gene. Normal individuals typically have around 2 to 8 G4C2 repeats, but individuals with FTD or ALS have from 500 to several thousand G4C2 repeats. The transcribed RNA of these repeats have been shown to form stable G quadruplexes, with evidence showing that the G4C2 repeats in DNA have the ability to form mixed parallel antiparallel G quadruplex structures as well. These RNA transcripts containing G4C2 repeats were shown to bind and separate a wide variety of proteins, including nucleolin. Nucleolin is involved in the synthesis and maturation of ribosomes within the nucleus, and separation of nucleolin by the mutated RNA transcripts impairs nucleolar function and ribosomal RNA synthesis. Fragile X mental retardation protein (FMRP) is a widely expressed protein coded by the FMR1 gene that binds to G quadruplex secondary structures in neurons and is involved in synaptic plasticity. FMRP acts as a negative regulator of translation, and its binding stabilizes G quadruplex structures in mRNA transcripts, inhibiting ribosome elongation of mRNA in the neuron's dendrite and controlling the timing of the transcript's expression. Mutations of this gene can cause the development of Fragile X Syndrome, autism, and other neurological disorders. Specifically, Fragile X Syndrome is caused by an increase from 50 to over 200 CGG repeats within exon 13 of the FMR1 gene. This repeat expansion promotes DNA methylation and other epigenetic heterochromatin modifications of FMR1 that prevent the transcription of the gene, leading to pathological low levels of FMRP.

Емдеу тәсілдері

Антисенс арқылы жүргізілетін араласулар және кішкентай молекулалы лигандтар – G квадроплекс кеңейту қайталануларымен байланысты неврологиялық ауруларды нысанаға алу үшін қолданылатын ең көп таралған стратегиялар. Сондықтан, бұл техникалар функцияны күшейту механизмі бар неврологиялық ауруларды нысанаға алу үшін ерекше пайдалы, яғни ген өнімінің өзгеруі жаңа функцияны немесе ген экспрессиясын тудырғанда; мұндай жағдай C9orf72 (9-шы хромосоманың 72-ші ашық оқу фреймі) ауруында анықталды. Антисенс терапиясы – синтезделген нуклеин қышқылдарының тізбектерін белгілі бір геннің өндірген mRNA-сына тікелей және нақты байланысу үшін пайдалану процесі, бұл оның белсенділігін жояды. Антисенс олигонуклеотидтері (АСО) көбінесе G квадроплекс GGGGCC кеңейту аймағының C9orf72 РНК-сын нысанаға алады, бұл C9orf72 клеткалық модельдеріндегі уыттылық деңгейін төмендетті. АСО бұрын функцияны күшейту механизмі бар басқа неврологиялық ауруларда қалыпты фенотиптерді қалпына келтіру үшін қолданылған, бірақ бұл G квадроплекс кеңейту аймақтары болмаған кезде жасалған. G квадроплекс алдау стратегиясы – G квадроплекстің ерекше құрылымдық ерекшеліктерін пайдаланып, қатерлі жасушаларды нысанаға алудың тағы бір перспективті тәсілі. Бұл стратегия G квадроплекс құрылымын имитациялайтын және транскрипция факторларымен байланысу үшін эндогенді G квадроплекстермен бәсекелесетін синтетикалық олигонуклеотидтерді жобалауды қамтиды. Алдаулар әдетте тұрақты G төртбұрышты құрылымды және олардың қасиеттерін оңтайландыру үшін өзгертуге болатын қысқа байланыс аймағын құрайтын G-ға бай тізбектен тұрады. Қатерлі жасушаларға енгізілгенде, алдау байланысқан транскрипция факторларын ұстап алып, олармен байланысады, нәтижесінде ген экспрессиясы реттеледі. Алдаулар SCID егешқұйрықтарындағы онкогенді KRAS-ты тежеуге сәтті қолданылды, бұл ісіктің өсуін азайтып, орташа өмір сүру ұзақтығын арттырды. Кішкентай молекулалы лигандтарды пайдалану – тағы бір жиі қолданылатын техника. Оларды неврологиялық бұзылыстарға себеп болатын G квадроплекс аймақтарын нысанаға алу үшін қолдануға болады. Шамамен 1000 түрлі G квадроплекс лигандтары бар, олардың барлығы олардың ароматтық сақиналары арқылы өзара әрекеттесе алады; бұл кішкентай молекулалы лигандтардың G квадроплекс аймақтарындағы жазық терминалды тетрадаларға үйілуіне мүмкіндік береді. Кішкентай молекулалы лигандтарды терапиялық тәсіл ретінде қолданудың кемшілігі – G квадроплекстердің бастапқы тізбектерінің, бағдарлануының, термодинамикалық тұрақтылығының және нуклеин қышқылы жіптерінің стехиометриясының өзгеруіне байланысты ерекшелікті басқару қиын. Қазіргі уақытқа дейін ең болмағанда бір кішкентай молекулалы лиганд бір ғана G квадроплекс тізбегі үшін толыққанды ерекше бола алмады. Алайда, TMPyP4 деп аталатын катиондық порфирин C9orf72 GGGGCC қайталану аймағына байланыса алады, бұл G квадроплекс қайталану аймағының ашылуына және оның ақуыздармен өзара әрекеттесуін жоғалтуына себеп болады, нәтижесінде оның функционалдығы жоғалады. Басты компоненті қорғасыннан тұратын кішкентай молекулалы лигандтар GGGGCC қайталану аймақтарын да нысанаға алады және нәтижесінде амиотрофиялық бүйірлік склероз (АБС) ауруымен ауыратын пациенттерден алынған нейрон жасушаларында қайталануға байланысты АТГ емес трансляция және РНК ошақтарының төмендеуіне әкеледі. Бұл кішкентай молекулалы лигандтардың GGGGCC аймақтарын нысанаға алудың тиімді және нәтижелі процесі екенін, сондай-ақ кішкентай молекулалы лигандтардың байланысу ерекшелігі ғылыми қауымдастық үшін қол жетімді мақсат екенін көрсетеді. Металл кешендері G4 ДНК байланыстырғыштары ретінде және демек, әлеуетті дәрілер ретінде қолдануға қолайлы ететін бірнеше ерекшеліктерге ие. Металл көптеген G4 байланыстырғыштарында негізінен құрылымдық рөл атқарады, бірақ электростатикалық өзара әрекеттесулер немесе нуклеобазалармен тікелей координация арқылы тікелей G4-термен өзара әрекеттесетін мысалдар да бар.

Antisense mediated interventions and small molecule ligands are common strategies used to target neurological diseases linked to G quadruplex expansion repeats. Therefore, these techniques are especially advantageous for targeting neurological diseases that have a gain of function mechanism, which is when the altered gene product has a new function or new expression of a gene; this has been detected in the C9orf72 (chromosome 9 open reading frame 72). Antisense therapy is the process by which synthesized strands of nucleic acids are used to bind directly and specifically to the mRNA produced by a certain gene, which will inactivate it. Antisense oligonucleotides (ASOs) are commonly used to target C9orf72 RNA of the G quadruplex GGGGCC expansion repeat region, which has lowered the toxicity in cellular models of C9orf72. ASOs have previously been used to restore normal phenotypes in other neurological diseases that have gain of function mechanisms, the only difference is that it was used in the absence of G quadruplex expansion repeat regions. The G quadruplex decoy strategy is another promising approach for targeting cancer cells by exploiting the unique structural features of the G quadruplex. The strategy involves designing synthetic oligonucleotides that mimic the G quadruplex structure and compete with the endogenous G quadruplexes for binding to transcription factors. These decoys are typically composed of a G rich sequence that can form a stable G quadruplex structure and a short linker region that can be modified to optimize their properties. When introduced to cancer cells the decoy can intercept associated transcription factors and bind them leading to the regulation of gene expression. Decoys have been successfully demonstrated to inhibit oncogenic KRAS in SCID mice leading to reduced tumour growth and increased median survival time. Another commonly used technique is the utilization of small molecule ligands. These can be used to target G quadruplex regions that cause neurological disorders. Approximately 1,000 various G quadruplex ligands exist in which they are able to interact via their aromatic rings; this allows the small molecule ligands to stack on the planar terminal tetrads within the G quadruplex regions. A disadvantage of using small molecule ligands as a therapeutic technique is that specificity is difficult to manage due to the variability of G quadruplexes in their primary sequences, orientation, thermodynamic stability, and nucleic acid strand stoichiometry. As of now, no single small molecule ligand has been able to be perfectly specific for a single G quadruplex sequence. However, a cationic porphyrin known as TMPyP4 is able to bind to the C9orf72 GGGGCC repeat region, which causes the G quadruplex repeat region to unfold and lose its interactions with proteins causing it to lose its functionality. Small molecule ligands, composed primarily of lead, can target GGGGCC repeat regions as well and ultimately decreased both repeat associated non ATG translation and RNA foci in neuron cells derived from patients with Amyotrophic lateral sclerosis (ALS). This provides evidence that small molecule ligands are an effective and efficient process to target GGGGCC regions, and that specificity for small molecule ligand binding is a feasible goal for the scientific community. Metal complexes have a number of features that make them particularly suitable as G4 DNA binders and therefore as potential drugs. While the metal plays largely a structural role in most G4 binders, there are also examples where it interacts directly with G4s by electrostatic interactions or direct coordination with nucleobases.