Введение

Структура в молекулярной биологии

В молекулярной биологии G-четырехслойные вторичные структуры (G4) формируются в нуклеиновых кислотах последовательностями, богатыми гуанином. Они имеют спиральную форму и содержат гуаниновые тетрады, которые могут образовываться из одной, двух или четырех цепей. Одномолекулярные формы часто встречаются в природе вблизи концов хромосом, более известных как теломерные области, и в транскрипционных регуляторных областях множества генов, как у микроорганизмов, так и у позвоночных. Четыре основания гуанина могут ассоциироваться посредством водородных связей типа Hoogsteen, образуя плоскую квадратную структуру, называемую гуаниновой тетрадой (G-тетрада или G-квартет), а две или более гуаниновых тетрад (из G-трактов – непрерывных участков гуанина) могут укладываться друг на друга, формируя G-квадроплекс. Расположение и связывание при формировании G-квадроплексов не случайны и выполняют весьма необычные функциональные задачи. Структура квадроплекса дополнительно стабилизируется присутствием катиона, особенно калия, который располагается в центральном канале между каждой парой тетрад. В зависимости от направления цепей или их фрагментов, формирующих тетрады, структуры могут описываться как параллельные или антипараллельные. Структуры G-квадроплексов могут быть предсказаны вычислительным путем на основе мотивов последовательностей ДНК или РНК, однако их фактические структуры могут быть весьма разнообразными как внутри, так и между мотивами, число которых может превышать 100 000 на геном. Их роль в основных генетических процессах является активной областью исследований в области теломер, регуляции генов и функциональной геномики.

История

Идентификация структур с высокой ассоциацией гуанина стала очевидной в начале 1960-х годов, благодаря обнаружению гелеподобных веществ, связанных с гуанинами. В частности, это исследование подробно описало четырехцепочечные структуры ДНК с высокой концентрацией гуанинов, которые позднее, в 1980-х годах, были идентифицированы в эукариотических теломерных областях ДНК. Важность открытия структуры G-квадроплекса была подчеркнута следующим высказыванием: «Если G-квадроплексы формируются так легко in vitro, значит, природа нашла способ использовать их in vivo». Аарон Клаг, лауреат Нобелевской премии по химии (1982). Интерес к in vivo функциям G-квадроплексов резко возрос после масштабного геномного анализа, который показал широкое распространение потенциальных G-квадроплекс-формирующих последовательностей (pG4) в промоторных областях генов человека, шимпанзе, мыши и крысы – результаты были представлены на Первой Международной встрече по G-квадроплексам, проходившей в апреле 2007 года в Луисвилле, штат Кентукки, – а также после наблюдения, что специфические ДНК-геликазы могут быть идентифицированы в местах накопления малых молекул, специфичных для этих структур ДНК, в клетках.

Структура и функциональная роль в геноме

После секвенирования генома человека было обнаружено множество последовательностей, богатых гуанином, обладающих потенциалом к формированию квадруплексов. В зависимости от типа клеток и фазы клеточного цикла, на динамическое образование квадруплексов влияют опосредующие факторы, такие как белки, связывающиеся с ДНК в хроматине – ДНК, плотно упакованной вокруг белков гистонов, – а также другие факторы окружающей среды и стрессовые воздействия. Например, количественная оценка термодинамики молекулярного перенаселения показывает, что антипараллельный G-квадруплекс стабилизируется молекулярным перенаселением. Этот эффект, по-видимому, обусловлен изменением гидратации ДНК и ее влиянием на образование водородных связей типа Hoogsteen. Эти квадруплексы, по-видимому, легко образуются на концах хромосом. Кроме того, склонность к образованию G-квадруплексов во время транскрипции в РНК-последовательностях, способных формировать взаимоисключающие структуры «шпильки» или G-квадруплексы, сильно зависит от положения последовательности, формирующей «шпильку». Поскольку ферменты репарации естественным образом распознают концы линейных хромосом как поврежденную ДНК и обрабатывают их соответствующим образом, что может нанести вред клетке, на концах линейных хромосом необходима четкая сигнализация и строгая регуляция. Теломеры обеспечивают эту сигнализацию. Теломеры, богатые гуанином и склонные к образованию G-квадруплексов, расположены на терминальных концах хромосом и помогают поддерживать целостность генома, защищая эти уязвимые концевые участки от нестабильности. Эти теломерные области характеризуются длинными участками повторяющихся последовательностей двухцепочечной ДНК CCCTAA:TTAGGG. Повторы заканчиваются 3'-выступом, состоящим из 10–50 одноцепочечных повторов TTAGGG. Гетеродимерный рибонуклеопротеиновый фермент теломераза добавляет повторы TTAGGG к 3'-концу цепей ДНК. На этих 3'-выступах богатый G-одноцепочечный участок может формировать вторичные структуры, такие как G-квадруплексы, если выступ содержит более четырех повторов TTAGGG. Присутствие этих структур препятствует удлинению теломер комплексом теломеразы.

Теломерные квадроплексы

Было показано, что теломерные повторы в различных организмах образуют эти четырехцепочечные структуры in vitro, а впоследствии было продемонстрировано их образование и in vivo. Человеческий теломерный повтор (который одинаков для всех позвоночных) состоит из множества повторов последовательности (TTAGGG), и четырехцепочечные структуры, формируемые этой последовательностью, могут представлять собой бусиноподобные структуры размером от 5 до 8 нм и были хорошо изучены методами ЯМР-спектроскопии, просвечивающей электронной микроскопии и рентгеноструктурного анализа. Образование этих четырехцепочечных структур в теломерах снижает активность фермента теломеразы, который отвечает за поддержание длины теломер и вовлечен примерно в 85% всех случаев рака. Это является активной мишенью для разработки лекарственных препаратов, включая теломестатин.

Нетеломерные квадроплексы

Квадруплексы присутствуют не только в теломерах. Анализ геномов человека, шимпанзе, мыши и крысы выявил огромное количество потенциальных последовательностей, способных образовывать G-квадруплексы (pG4), в нетеломерных областях. Значительное число нетеломерных G-квадруплексов было обнаружено в промоторах генов и оказалось консервативным для различных видов. Хотя эти исследования и предсказывали регуляцию генов посредством G-квадруплексов, маловероятно, что все pG4 формируются *in vivo*. Протоонкоген c-myc образует квадруплекс в нуклеазочувствительной области, критически важной для активности гена. Другие гены, образующие G-квадруплексы в промоторных областях, включают куриный ген β-глобина, человеческую убиквитин-лигазу RFP2, а также протоонкогены c-kit, bcl-2, VEGF, H-ras и N-ras. Были проведены полногеномные исследования, основанные на правилах формирования квадруплексов, которые идентифицировали 376 000 потенциальных квадруплексных последовательностей (PQS) в геноме человека, хотя не все из них, вероятно, формируются *in vivo*. Аналогичные исследования выявили потенциальные G-квадруплексы у прокариот, в частности у бактерии *E. coli*. Существует несколько возможных моделей влияния квадруплексов на активность генов, как путем активации, так и путем подавления. Одна из моделей представлена ниже: образование G-квадруплекса в промоторе или рядом с ним блокирует транскрипцию гена и, следовательно, инактивирует его. В другой модели квадруплекс, образованный на некодирующей нити ДНК, помогает поддерживать открытую конформацию кодирующей нити ДНК и усиливает экспрессию соответствующего гена.

Функция

Предполагается, что формирование квадроплексов играет роль в переключении тяжелых цепей иммуноглобулинов. Геликаза DEAH/RHA, DHX36, также была идентифицирована как ключевой G-квадруплексный резольваз. В 2009 году было обнаружено, что белок-супрессор метастазов NM23H2 (также известный как NME2) напрямую взаимодействует с G-квадруплексом в промоторе гена c-myc и транскрипционно регулирует c-myc. В последнее время было показано, что NM23H2 взаимодействует с G-квадруплексом в промоторе гена человеческой теломеразы (hTERT) и регулирует экспрессию hTERT. В 2019 году было продемонстрировано, что фактор связывания теломер 2 (TRF2 или TERF2) связывается с тысячами нетелемерных G-квадруплексов в геноме человека, согласно данным TRF2 ChIP-seq. Существует множество исследований, связывающих квадроплексы как с положительной, так и с отрицательной регуляцией транскрипции, включая эпигенетическую регуляцию генов, таких как hTERT. Роль квадроплексной структуры в контроле трансляции изучена недостаточно. Прямая визуализация G-квадруплексных структур в клетках человека, а также кокристаллическая структура РНК-геликазы, связанной с G-квадруплексом, предоставили важные подтверждения их значимости для клеточной биологии. Потенциальная положительная и отрицательная роль квадроплексов в репликации и функции теломеров остается предметом дискуссий. Т-петли и G-квадруплексы описываются как две третичные структуры ДНК, которые защищают концы теломеров и регулируют длину теломеров.

Регулирование генома путем формирования G-квадруплексных структур

Многие процессы регуляции генома связаны с образованием G-квадруплексных структур, что обусловлено их огромной ролью в репарации ДНК в апуриновых/апиримидиновых участках, также известных как AP-сайты. Разработана новая методика картирования AP-сайтов, известная как AP-seq, которая использует биотин-меченый алдегид-реактивный зонд (ARP) для маркировки определенных регионов генома, где наблюдается значительное повреждение AP-сайтов. Другой метод полногеномного картирования, известный как ChIP-seq, был использован для картирования как повреждений в AP-сайтах, так и фермента, ответственного за их репарацию – эндонуклеазы AP 1 (APE1). Оба метода полногеномного картирования, ChIP-seq и ARP, показали, что повреждение AP-сайтов происходит не случайным образом. Повреждение AP-сайтов также было более распространено в определенных регионах генома, содержащих специфические активные промоторные и энхансерные маркеры, некоторые из которых связаны с областями, ответственными за аденокарциному легких и колоректальный рак. Повреждение AP-сайтов оказалось преобладающим в PQS-регионах генома, где образование G-квадруплексных структур регулируется и стимулируется процессом репарации ДНК посредством иссечения основания (BER). Считается, что эти G-квадруплексные структуры формируются в промоторных областях ДНК за счет суперспирализации, которая способствует раскручиванию двойной спирали ДНК и, в свою очередь, образованию петель, формирующих G-квадруплексные структуры в гуанин-богатых областях. Путь BER активируется при обнаружении окислительного повреждения оснований ДНК, где структуры, такие как 8-оксогуанин ДНК-гликозилаза 1 (OGG1), APE1 и G-квадруплексы, играют важную роль в его репарации. Эти ферменты участвуют в BER для восстановления определенных повреждений ДНК, таких как 7,8-дигидро-8-оксогуанин (8-oxoG), который образуется при окислительном стрессе на гуаниновых основаниях.

Роль эндогенного окисленного повреждения основы ДНК в образовании G4

Гуанин (G) основания в G-квадроплексе обладают самым низким окислительно-восстановительным потенциалом, что делает их более восприимчивыми к образованию 8-оксогуанина (8-oxoG) – эндогенного окисленного повреждения основания ДНК в геноме. В связи с тем, что у гуанина потенциал восстановления электронов ниже, чем у других нуклеотидных оснований, 8-оксо-2'-дезоксигуанозин (8-oxo dG) является известным основным продуктом окисления ДНК. Его концентрация используется для измерения окислительного стресса в клетке. При окислительном повреждении ДНК возможное структурное изменение гуанина после ионизирующего излучения приводит к образованию энольной формы 8-OH Gua. Этот окисленный продукт формируется в результате таутомерного сдвига от исходного поврежденного гуанина 8-oxo Gua и представляет собой повреждение ДНК, вызывающее изменения в структуре. Эта форма позволяет ферменту OGG1, участвующему в удалении оснований (BER), связываться и удалять окислительные повреждения при помощи APE1, что приводит к образованию AP-сайта. 8-оксо-dG, при образовании, способен инактивировать OGG1, тем самым препятствуя восстановлению повреждений ДНК, вызванных окислением гуанина. После введения 8-oxo dG в ген тимидинкиназы человека было установлено, что если 8-oxo dG остается неконтролируемым и не восстанавливается системой BER, это может привести к частым мутациям и, в конечном итоге, к канцерогенезу. Этот процесс приводит четыре основания в тесное взаимодействие, удерживаемые вместе парой оснований Hoogsteen. После этой стадии APE1 ацетилируется множественными остатками лизина на хроматине, образуя ацетилированный APE1 (AcAPE1). AcAPE1 также играет важную роль, поскольку позволяет APE1 связываться в течение более длительного времени за счет замедления его диссоциации от последовательности, что повышает эффективность процесса восстановления. Деацетилирование AcAPE1 является движущей силой для загрузки этих TF, при этом APE1 диссоциирует от G-квадроплексных структур. В исследовании, когда экспрессия APE1 и AcAPE1 в клетке была снижена, образование G-квадроплексных структур было ингибировано, что подтверждает важность APE1 для формирования этих структур. Однако не все G-квадроплексные структуры требуют APE1 для формирования; более того, некоторые из них формировали более крупные G-квадроплексные структуры в его отсутствие.

Регионы-продвигатели

Наряду с ассоциацией G-квадруплексов в теломерных областях ДНК, G-квадруплексные структуры были идентифицированы в различных промоторных областях человеческих протоонкогенов. Структуры, наиболее часто встречающиеся в промоторных областях этих онкогенов, как правило, представляют собой параллельно-цепочечные G-квадруплексные структуры ДНК. Некоторые из этих онкогенов включают c-KIT, PDGF-A, c-Myc и VEGF, что подчеркивает важность этой вторичной структуры в росте и развитии рака. Хотя формирование G-квадруплексных структур в некоторой степени варьируется для различных промоторных областей онкогенов, последовательная стабилизация этих структур наблюдается при развитии рака. Современные терапевтические исследования активно направлены на воздействие на эту стабилизацию G-квадруплексных структур для подавления неконтролируемого роста и деления клеток. Особую роль в регуляции белкового продукта c-Myc играет генный путь c-Myc. Этот продукт, белок c-Myc, участвует в процессах апоптоза и роста или развития клеток, а также осуществляет транскрипционный контроль над обратной транскриптазой человеческого теломеразы. Взаимодействие G-квадруплекса промотора c-Myc с NM23H2 было показано регулировать c-Myc в раковых клетках в 2009 году.

Другой генный путь связан с геном VEGF, фактором роста эндотелия сосудов, который играет роль в процессе ангиогенеза, то есть формирования новых кровеносных сосудов. Формирование внутримолекулярной G-квадруплексной структуры было продемонстрировано в исследованиях полипуринового тракта промоторной области гена VEGF. Недавние исследования роли G-квадруплексной функции in vivo показали, что стабилизация G-квадруплексных структур регулирует транскрипцию гена VEGF, ингибируя факторы транскрипции в этом пути. Внутримолекулярные G-квадруплексные структуры формируются преимущественно за счет обильной последовательности гуанина в промоторной области этого конкретного пути. Ген ингибитора клеточного цикла, киназы 1 CDKN1A (также известного как p21), содержит промоторный G-квадруплекс. Взаимодействие этого G-квадруплекса с TRF2 (также известным как TERF2) привело к эпигенетической регуляции p21, что было проверено с использованием лиганда, связывающего G-квадруплексы, 360A. Индуцируемый гипоксией фактор 1α, HIF-1α, участвует в передаче сигналов при раке посредством связывания с элементом гипоксического ответа (HRE) в условиях гипоксии для запуска процесса ангиогенеза. Недавние исследования этого конкретного генного пути показали, что полипуриновый и полипиримидиновый участки обеспечивают транскрипцию этого гена и формирование внутримолекулярной G-квадруплексной структуры. Однако необходимы дальнейшие исследования, чтобы определить, регулирует ли образование G-квадруплекса экспрессию этого гена положительно или отрицательно. Онкоген c-kit связан с путем, кодирующим RTK, который показал повышенные уровни экспрессии при определенных типах рака. Богатая гуанином последовательность в этой промоторной области продемонстрировала способность формировать различные квадруплексы. Современные исследования этого пути сосредоточены на выяснении биологической функции этого конкретного квадруплексного образования в пути c-kit, при этом эта квадруплексная последовательность была обнаружена у различных видов. Другой онкогенный путь, включающий PDGF-A, тромбоцитарный фактор роста, участвует в процессе заживления ран и функционирует как митогенный фактор роста клеток. Высокие уровни экспрессии PDGF связаны с увеличением роста клеток и раком. Наличие богатой гуанином последовательности в промоторной области PDGF-A продемонстрировало способность формировать внутримолекулярные параллельные G-квадруплексные структуры и предположительно играет роль в транскрипционной регуляции PDGF-A. Однако исследования также выявили наличие G-квадруплексных структур в этой области из-за взаимодействия TMPyP4 с этой последовательностью промотора.

Терапевтические средства

Теломеры обычно состоят из G-квадруплексов и остаются важными объектами для терапевтических исследований и открытий. Эти комплексы обладают высоким сродством к порфириновым кольцам, что делает их эффективными противораковыми агентами. Однако применение TMPyP4 было ограничено из-за его неселективности в отношении теломер раковых клеток и нормальной двухцепочечной ДНК (dsDNA). Для решения этой проблемы был синтезирован аналог TMPyP4, известный как 5Me, который нацелен исключительно на G-квадруплексную ДНК, более эффективно ингибируя рост раковых клеток, чем TMPyP4. Разработка и конструирование лигандов остается важной областью исследований в области терапевтических средств, благодаря обилию G-квадруплексов и их многочисленным конформационным различиям. Один из типов лигандов, включающий производное хинолина, SYUIQ 05, использует стабилизацию G-квадруплексов в промоторных областях для ингибирования продукции как белка c-Myc, так и обратной транскриптазы человеческого теломеразы (hTERT). Этот основной механизм воздействия на данную область приводит к прекращению удлинения теломеразы, что влечет за собой остановку развития клеток. Для открытия единой генной мишени, позволяющей минимизировать нежелательные реакции и повысить противоопухолевую активность, необходимы дальнейшие исследования. TMPyP4, катионовый порфирин, является более известным лигандом, связывающимся с G4 и способствующим подавлению c-Myc. Механизм связывания TMPyP4 с G4 аналогичен MM41: кольцо укладывается на внешний G-квартет, а боковые цепи взаимодействуют с петлями G4. При разработке лигандов для связывания с G-квадруплексами, они проявляют более высокое сродство к параллельно свернутым G-квадруплексам. Было установлено, что лиганды с меньшими боковыми цепями лучше связываются с квадруплексами, поскольку меньшие лиганды обладают более концентрированной электронной плотностью. Кроме того, водородные связи лигандов с меньшими боковыми цепями короче и, следовательно, прочнее. Лиганды с подвижными боковыми цепями, способными вращаться вокруг центрального хромофора, более прочно ассоциируются с G-квадруплексами, поскольку конформация петель G4 и боковых цепей лиганда могут выстраиваться в линию.

Методы предсказания четырехкратного действия

Определение и прогнозирование последовательностей, способных формировать квадроплексы, является важным инструментом для дальнейшего понимания их роли. Обычно для поиска возможных внутрицепочечных квадроплексных формирующих последовательностей используется простое сопоставление с образцом: d(G3+N1 7G3+N1 7G3+N1 7G3+), где N – любое нуклеотидное основание (включая гуанин). Это правило широко используется в онлайн-алгоритмах. Хотя это правило эффективно выявляет сайты формирования G-квадроплексов, оно также идентифицирует подмножество неполных гомопуриновых зеркальных повторов, способных к образованию триплексов и C-петли i-мотива. Более того, эти последовательности также способны формировать структуры со сдвигом и складки, которые являются неявными промежуточными звеньями в формировании квадроплексных структур. В одном исследовании было обнаружено, что наблюдаемое количество на пару оснований (то есть частота) этих мотивов быстро возросло у эуметазоев, для которых доступны полные геномные последовательности. Это позволяет предположить, что эти последовательности могут подвергаться положительному отбору, обеспечиваемому эволюцией систем, способных подавлять образование не-B-структур. В последнее время были разработаны современные веб-инструменты для идентификации последовательностей, формирующих G-квадроплексы, включая удобную для пользователя и общедоступную версию G4Hunter, основанную на подходе скользящего окна, или G4RNA Screener, основанную на алгоритме машинного обучения.

Методы исследования G-квадруплексов

Для выявления G-квадруплексов разработан ряд экспериментальных методов. Эти методы можно условно разделить на два класса: биофизические и биохимические.

Биохимические методы

Для изучения формирования G-четверократных структур в более широком контексте последовательности были использованы биохимические методы. В анализе остановки ДНК-полимеразы формирование G-квадруплекса в ДНК-матрице может служить препятствием и вызывать остановку полимеразы, что приводит к прекращению удлинения праймера. Метод, основанный на использовании диметилсульфата (DMS) с последующим расщеплением пиперидином, использует тот факт, что формирование G-квадруплекса предотвращает метилирование гуанина в положении N7, вызываемое DMS, что приводит к появлению защитного паттерна в области G-квадруплекса ДНК после расщепления пиперидином.

Биофизические методы

Топология структуры G-квадруплекса может быть определена путем мониторинга положительных или отрицательных сигналов циркулярного дихроизма (CD) на определенных длинах волн. Параллельные G-квадруплексы имеют отрицательные и положительные CD-сигналы при 240 и 262 нм соответственно, в то время как антипараллельные G-квадруплексы демонстрируют эти сигналы при 262 и 295 нм соответственно. Для подтверждения формирования G-квадруплекса также следует проводить CD-эксперименты в условиях, не стабилизирующих G-квадруплекс (Li+) и стабилизирующих G-квадруплекс (например, K+ или с использованием G-квадруплексных лигандов), и проводить сканирование в область дальнего УФ-диапазона (180–230 нм). Аналогично, термостабильность структуры G-квадруплекса можно определить, наблюдая за УФ-сигналом при 295 нм. При разворачивании G-квадруплекса УФ-поглощение при 295 нм уменьшается, что приводит к гипохромному сдвигу – характерной особенности структуры G-квадруплекса. Другим подходом к обнаружению G-квадруплексов являются методы, основанные на нанопорах. Было показано, что биологические нанопоры могут обнаруживать G-квадруплексы на основе исключения по размеру и специфического взаимодействия G-квадруплекса с белковой нанополостью. Новый подход сочетает в себе нанопоры твердого тела и нанотехнологии ДНК для безметокного обнаружения G-квадруплексов, их картирования на двухцепочечной ДНК и мониторинга формирования G-квадруплексов.

Роль в неврологических расстройствах

G-квадроплексы связаны с неврологическими расстройствами посредством двух основных механизмов. Первый – через расширение G-повторов в генах, приводящее к образованию G-квадроплексных структур, непосредственно вызывающих заболевание, как в случае с геном C9orf72 и амиотрофическим боковым склерозом (АБС) или лобно-височной деменцией (ЛВД). Второй механизм – мутации, влияющие на экспрессию белков, связывающих G-квадроплексы, как наблюдается в гене хрупкой Х-хромосомы умственной отсталости 1 (FMR1) и синдроме хрупкой Х-хромосомы. Ген C9orf72 кодирует белок C9orf72, который обнаруживается во всем мозге в нейронной цитоплазме и на пресинаптических терминалах. Мутации гена C9orf72 связаны с развитием ЛВД и АБС. Эти два заболевания имеют причинно-следственную связь с повторами GGGGCC (G4C2) в первом интроне гена C9orf72. У здоровых людей обычно наблюдается от 2 до 8 повторов G4C2, в то время как у людей с ЛВД или АБС – от 500 до нескольких тысяч повторов G4C2. Показано, что транскрибированная РНК этих повторов образует стабильные G-квадроплексы, и имеются данные о том, что G4C2-повторы в ДНК также способны формировать смешанные параллельно-антипараллельные G-квадроплексные структуры. Эти РНК-транскрипты, содержащие повторы G4C2, связывают и разделяют широкий спектр белков, включая нуклеолин. Нуклеолин участвует в синтезе и созревании рибосом в ядре, а разделение нуклеолина мутировавшими РНК-транскриптами нарушает функцию ядрышка и синтез рибосомной РНК. Белок хрупкой Х-хромосомы умственной отсталости (FMRP) – широко экспрессируемый белок, кодируемый геном FMR1, который связывается с G-квадроплексными вторичными структурами в нейронах и участвует в синаптической пластичности. FMRP действует как отрицательный регулятор трансляции, и его связывание стабилизирует G-квадроплексные структуры в мРНК-транскриптах, ингибируя элонгацию рибосомы мРНК в дендритах нейрона и контролируя время экспрессии транскрипта. Мутации этого гена могут вызывать развитие синдрома хрупкой Х-хромосомы, аутизма и других неврологических расстройств. В частности, синдром хрупкой Х-хромосомы вызван увеличением от 50 до более чем 200 CGG-повторов в экзоне 13 гена FMR1. Это расширение повторов способствует метилированию ДНК и другим эпигенетическим модификациям гетерохроматина FMR1, которые препятствуют транскрипции гена, приводя к патологически низким уровням FMRP.

Терапевтические подходы

Антисмысловые вмешательства и лиганды малых молекул – распространенные стратегии, используемые для воздействия на неврологические заболевания, связанные с расширениями G-квадруплексов. Поэтому эти методы особенно эффективны при лечении неврологических заболеваний с механизмом усиления функции, когда измененный генный продукт приобретает новую функцию или изменяется экспрессия гена; это наблюдалось при C9orf72 (хромосома 9, открытая рамка считывания 72). Антисмысловая терапия – это процесс, при котором синтезированные цепи нуклеиновых кислот используются для прямого и специфического связывания с мРНК, производимой определенным геном, что приводит к ее инактивации. Антисенсовые олигонуклеотиды (АСО) обычно используются для воздействия на РНК C9orf72 в области повторов расширения G-квадруплекса GGGGCC, что снизило токсичность в клеточных моделях C9orf72. ASO ранее применялись для восстановления нормальных фенотипов при других неврологических заболеваниях с механизмами усиления функции, отличие лишь в том, что они использовались в отсутствие областей расширения G-квадруплексных повторов. Стратегия использования G-квадруплексных «ловушек» – еще один перспективный подход для воздействия на раковые клетки, использующий уникальные структурные особенности G-квадруплексов. Эта стратегия включает разработку синтетических олигонуклеотидов, имитирующих структуру G-квадруплекса и конкурирующих с эндогенными G-квадруплексами за связывание с факторами транскрипции. Эти «ловушки» обычно состоят из G-богатой последовательности, способной формировать стабильную структуру G-квадруплекса, и короткого линкерного участка, который можно модифицировать для оптимизации их свойств. При введении в раковые клетки «ловушка» может перехватывать связанные с ней факторы транскрипции и связываться с ними, что приводит к регуляции экспрессии генов. Показано, что «ловушки» успешно ингибируют онкогенный KRAS у мышей с дефицитом иммунной системы (SCID), что приводит к уменьшению роста опухоли и увеличению медианной выживаемости. Другой часто используемый метод – использование лигандов малых молекул. Их можно использовать для воздействия на G-квадруплексные области, вызывающие неврологические расстройства. Существует около 1000 различных лигандов G-квадруплексов, способных взаимодействовать посредством своих ароматических колец; это позволяет лигандам малых молекул укладываться на плоские терминальные тетрады в пределах G-квадруплексных областей. Недостатком использования лигандов малых молекул в качестве терапевтического метода является сложность обеспечения специфичности из-за изменчивости G-квадруплексов в их первичных последовательностях, ориентации, термодинамической стабильности и стехиометрии цепей нуклеиновых кислот. На сегодняшний день ни один лиганд малых молекул не обладает абсолютной специфичностью к одной G-квадруплексной последовательности. Однако катионовый порфирин, известный как TMPyP4, способен связываться с областью повторов C9orf72 GGGGCC, что приводит к разворачиванию G-квадруплексной области повторов и потере ее взаимодействия с белками, что вызывает потерю ее функциональности. Лиганды малых молекул, состоящие в основном из соединений свинца, также могут воздействовать на области повторов GGGGCC и в конечном итоге снижать как трансляцию, не связанную с ATG, так и РНК-фокусы в нейронах, полученных от пациентов с амиотрофическим боковым склерозом (АБС). Это подтверждает, что лиганды малых молекул являются эффективным и действенным способом воздействия на области GGGGCC, и что специфичность связывания лигандов малых молекул является достижимой целью для научного сообщества. Металлические комплексы обладают рядом свойств, которые делают их особенно подходящими в качестве связующих веществ для ДНК G4 и, следовательно, потенциальных лекарственных средств. Хотя металл в большинстве связующих веществ G4 играет преимущественно структурную роль, существуют также примеры, когда он взаимодействует непосредственно с G4 посредством электростатических взаимодействий или прямой координации с нуклеобазами.