Ағылшыншамен салыстырыңыз: абзацты басыңыз — түпнұсқа терезеде ашылады. Абзац астындағы EN түймесі оны мәтін ішінде көрсетеді.
Мазмұны
Кіріспе
Өте көп қабаттасу полимераза тізбектік реакциясы (немесе OE ПТР) – ПТР-дың бір түрі. Ол сондай-ақ қабаттасу арқылы біріктіру / ілгектің ұзындығы арқылы біріктіру (SOE) ПТР деп те аталады. Ол бірнеше кішірек екі тізбекті ДНК фрагменттерін үлкен ДНК тізбегіне құрастыру үшін қолданылады. OE ПТР тізбектің нақты нүктелеріне мутациялар енгізу үшін немесе кішірек ДНК фрагменттерінен бейімделген ДНК тізбегін үлкен полинуклеотидке құрастыру үшін кеңінен пайдаланылады.
The overlap extension polymerase chain reaction (or OE PCR) is a variant of PCR. It is also referred to as Splicing by overlap extension / Splicing by overhang extension (SOE) PCR. It is used assemble multiple smaller double stranded DNA fragments into a larger DNA sequence. OE PCR is widely used to insert mutations at specific points in a sequence or to assemble custom DNA sequence from smaller DNA fragments into a larger polynucleotide.
ДНҚ молекулаларын біріктіру
ПТР реакцияларының көпшілігі сияқты, әрбір тізбек үшін екі праймер – әр ұшына біреуден қолданылады. Екі ДНҚ молекуласын біріктіру үшін, біріктірілуі тиіс ұштарында арнайы праймерлер пайдаланылады. Әрбір молекула үшін, біріктірілуі тиіс ұшқындағы праймер, екінші молекуланың ұшына толықтырғыш 5' қысқа артықшылықпен құрастырылады. Репликация кезінде отырғызудан кейін, ДНҚ жаңа тізбекпен ұзарады, ол біріктірілуі тиіс молекулаға толықтырғыш болады. Екі ДНҚ молекуласы осылайша ұзартылғаннан кейін, олар араластырылады және тек алыс ұштарына арналған праймерлермен ПТР жүргізіледі. Енбеген толықтырғыш тізбектер праймерлер ретінде қызмет етеді және екі тізбек біріктіріледі. Бұл әдіс, басқа генді біріктіру әдістеріне қарағанда, шектеу ферменттерінің қажеттілігін жоқ ететін артықшылығына ие. Жоғары өнім алу үшін, кейбір праймерлер асимметриялық ПТР-дегідей артық мөлшерде қолданылады.
As in most PCR reactions, two primers—one for each end—are used per sequence. To splice two DNA molecules, special primers are used at the ends that are to be joined. For each molecule, the primer at the end to be joined is constructed such that it has a 5' overhang complementary to the end of the other molecule. Following annealing when replication occurs, the DNA is extended by a new sequence that is complementary to the molecule it is to be joined to. Once both DNA molecules are extended in such a manner, they are mixed and a PCR is carried out with only the primers for the far ends. The overlapping complementary sequences introduced will serve as primers and the two sequences will be fused. This method has an advantage over other gene splicing techniques in not requiring restriction sites. To get higher yields, some primers are used in excess as in asymmetric PCR.
Мутациялардың енуі
ДНҚ тізбегіне мутация енгізу үшін арнайы праймер жасалады. Праймерде бір ғана алмастыру болуы мүмкін немесе оның 5' ұшында жаңа тізбек болуы мүмкін. Егер жойылса, жойылған бөліктің 5' жағындағы тізбек қосылады, себебі праймердің 3' ұшы шаблондық тізбекпен толық сәйкес келуі керек, осылайша праймер шаблондық ДНҚ-мен жеткілікті деңгейде байланыса алады. Праймерді шаблонға қосудан кейін ДНҚ репликациясы шаблонның соңына дейін жалғасады. Дуплекс денатурацияланады және екінші праймер бірінші праймерден алынған тізбекті қамтитын, жаңа түзілген ДНҚ тізбегіне қосылады. Репликация мутацияны қамтитын қажетті тізбектің жібін жасайды. Дуплекс қайтадан денатурацияланады және алғашқы праймер енді соңғы ДНҚ тізбегіне байланыса алады. Репликация реакциясы толық димерленген ДНҚ фрагментін жасауды жалғастырады. ДНҚ-ны күшейту үшін, ПТР циклдарынан кейін, үлгі агарозалық гель электрофорезі арқылы бөлінеді, содан кейін жинау үшін электроэлюция жасалады. ~110 нуклеотидтен асатын олигонуклеотидтерді тиімді өндіру өте қиын, сондықтан тізбекке 110 нұклеотидтік праймерге қарағанда одан әрі мутацияны енгізу үшін үстіне жабу ПТР-ін қолдану қажет. Үстіне жабу ПТР-інде (ОЭ ПТР) модификацияланатын тізбек жоғарыда сипатталған әдіс арқылы мутациялары қарама-қарсы ұштарында болатын екі модификацияланған жіпті жасау үшін қолданылады. Араластырып, денатурациялағаннан кейін жіптерге диаграммада көрсетілгендей үш түрлі комбинацияны жасау үшін байланысуға рұқсат етіледі. Тек 5' ұшында үстіне жабыспайтын дуплекс 3'-5' бағытында ДНҚ полимеразамен кеңейтілуге мүмкіндік береді. Үстіне жабу ПТР реакциясының кеңейтілгеннен кейін ПТР қоспасы немесе тиісті мөлшердегі элюцияланған фрагменттер бастапқы мутагенді ПТР реакцияларында қолданылған ең шеткі праймерлерді қолдана отырып, қалыпты ПТР-ға түседі. Сонымен қатар, ОЭ ПТР және асимметриялық ПТР комбинациясын сайтқа бағытталған мутагенездің тиімділігін арттыру үшін қолдануға болады.
To insert a mutation into a DNA sequence, a specific primer is designed. The primer may contain a single substitution or contain a new sequence at its 5' end. If a deletion is required, a sequence that is 5' of the deletion is added, because the 3' end of the primer must have complementarity to the template strand so that the primer can sufficiently anneal to the template DNA. Following annealing of the primer to the template, DNA replication proceeds to the end of the template. The duplex is denatured and the second primer anneals to the newly formed DNA strand, containing sequence from the first primer. Replication proceeds to produce a strand of the required sequence, containing the mutation. The duplex is denatured again and the first primer can now bind to the latest DNA strand. The replication reaction continues to produce a fully dimerised DNA fragment. After further PCR cycles, to amplify the DNA, the sample can be separated by agarose gel electrophoresis, followed by electroelution for collection. Efficiently generating oligonucleotides beyond ~110 nucleotides in length is very difficult, so to insert a mutation further into a sequence than a 110 nt primer will allow, it is necessary to employ overlap extension PCR. In OE PCR the sequence being modified is used to make two modified strands with the mutation at opposite ends, using the technique described above. After mixing and denaturation, the strands are allowed to anneal to produce three different combinations as detailed in the diagram. Only the duplex without overlap at the 5' end will allow extension by DNA polymerase in 3' to 5' direction. Following the extension of the OE PCR reaction, the PCR mix or the eluted fragments of appropriate size are subject to normal PCR, using the outermost primers used in the initial, mutagenic PCR reactions. In addition, the combination of OE PCR and asymmetric PCR could be used to improved the efficiency of site directed mutagenesis.
Молекулалық клондаудағы қолдану
Мутацияларды енгізуден басқа, үстіне кеңейту ПТР (Overlap Extension PCR) кез келген позицияда қажетсіз нуклеотидтерді қоспай, күрделі ДНК тізбектерін құрастыру үшін кеңінен қолданылады. Бұл мүмкін, себебі ҮКЭ ПТР (OE PCR) қажетті ретте DNA фрагменттерін мүжілсіз біріктіруді басқару үшін толықтыратын ұзын тіркемелерді пайдалануға негізделген. Бұл ҮКЭ ПТР (OE PCR) және Гибсон құрастыруы сияқты ұзақ гомологияға негізделген клондау әдістерінің басты артықшылығы, олар дәстүрлі шектеу ферменттерін қорыту және лигатуралау клондау әдістерінің шектеулерін жоңдап береді. ҮКЭ ПТР (OE PCR) арқылы жеке ДНК тізбектерін құрастыру үш негізгі қадамнан тұрады. Біріншіден, жеке ДНК тізбектері әртүрлі матрицалардан ПТР (PCR) арқылы көбейтіліп, қажетті толықтыратын ұзын тіркемелермен шектеледі. Екіншіден, алдын ала алынған ПТР (PCR) өнімдері үстіне кеңейту ПТР (overlap extension PCR) реакциясына біріктіріледі, онда толықтыратын ұзын тіркемелер жұптар түзеп байланысады, бұл полимеразаға ДНК тізбегін ұзартуға мүмкіндік береді. Соңында, сыртқы ұзын тіркемелерге бағытталған сыртқы праймерлер қолданылады және қажетті ДНК өнімі соңғы ПТР (PCR) реакциясында күшейтіледі.
Besides the introduction of mutations, Overlap Extension PCR is widely used to assemble complex DNA sequences without the introduction of undesired nucleotides at any position. This is possible since OE PCR relies on the utilization of complementary overhangs to guide the scarless splicing of custom DNA fragments in a desired order. This is the main advantage of OE PCR and other long homology based cloning methos such as Gibson assembly, which overcome the limitations of traditional restriction enzyme digestion and ligation cloning methods. Assembly of custom DNA sequences with OE PCR consists on three main steps. First, individual DNA sequences are amplified by PCR from different templates and flanked with the required complementary overhangs. Second, the formerly obtained PCR products are combined together into the overlap extension PCR reaction, where the complementary overhangs bind pair wise allowing the polymerase to extend the DNA strand. Eventually, outer primers targeting the external overhangs are used and the desired DNA product is amplified in the final PCR reaction.
Техникалық ескертулер
ОЭ ПТР негізіндегі ДНК құрастырудың жалпы сәттілігі бірнеше факторға байланысты, олардың ең маңыздылары құрастырылатын ДНК тізбегінің ішкі қасиеттері, жабысушы үстіңгі бөліктердің тізбегі мен ұзындығы, соңғы күшейту үшін сыртқы праймерлердің дизайны және ПТР реакциясының жағдайлары. Әдетте, бір ОЭ ПТР реакциясында бір уақытта 2-ден 6-ға дейін фрагменттерді біріктіруге болады. Фрагменттердің жеткілікті өзара әрекеттесуін қамтамасыз ету үшін үстіңгі бөліктердің ұзындығы кем дегенде 40 нуклеотид болуы керек. Соңғы күшейту праймерлері әдетте ПТР үшін жалпы ережелерге сәйкес жобаланады, бірақ олар стандартты ПТР реакцияларындағыдан 2-5 есе төмен концентрацияда қолданылады, себебі бұл қажетсіз күшейтуді азайтады. Сонымен қатар, түзетуші ДНК полимеразаларын қолдану жоғары ұсынылады.
The overall success of OE PCR based DNA assemblies relies on several factors, being the most relevant ones the instrinsic features of the DNA sequence to assemble, the sequence and length of the overlapping overhangs, the design of outer primers for the final amplification and the conditions of the PCR reaction. Normally, from 2 to 6 fragments can be spliced simultaneously into a single OE PCR reaction. Overhangs should be at least 40 nucleotides long to ensure adequate interaction between fragments. Final amplification primers are commonly designed following general guidelines for PCR, however they are used in 2 to 5 times lower concentration than in standard PCR reactions, as it this has been shown to reduce undesired amplifications. Additionally the utilization of proofreading DNA polymerases is highly recommended.