Annexin A5 affinity assay

Кіріспе

Молекулалық биологияда анексин А5 аффинділік сынағы - апоптоздан өтетін жасушалардың санын өлшеу үшін тест. Аноксинді A5 белдеуін пайдаланып, апоптоздық және өлі жасушаларды белгілейді, содан кейін олардың саны ағыс цитометриясы немесе флуоресценттік микроскоп арқылы есептеледі. Анексин a5 белогы кальцийге тәуелді түрде мембрананың ішкі жапырағында ғана кездесетін фосфатидилсеринді құрайтын мембраналық беттер арқылы апоптоздық жасушаларға байланады.

Өмірбаян

Апоптоз - бұл жасушалардың өлімін бағдарламалаудың бір түрі, оны ағза қажетсіз, зақымдалған немесе ескірген жасушаларды тіндерден алу үшін қолданады. Апоптоздық жасушаларды алып тастау фагоцитоз арқылы макрофагтар мен дендриттік жасушалар сияқты ақ қан жасушаларымен жүзеге асырылады. Фагоциттік ақ қан жасушалары апоптотикалық жасушаларды жасуша бетіндегі теріс зарядталған фосфолипидтердің (фосфатидилсериннің) әсерінен таниды. Қалыпты жасушаларда жағымсыз фосфолипидтер жасушалық мембрананың ішкі жағында болады, ал мембрананың сыртқы бетін зарядталмаған фосфолипидтер алады. Клетка апоптозға енгеннен кейін теріс зарядталған фосфолипидтер скримблаза деп аталатын гипотетикалық белок арқылы клетканың сыртқы бетіне тасымалданады. Фагоциттік ақ қан жасушалары апоптоздық жасушалардың бетіндегі теріс зарядталған фосфолипидтерге байланатын және оларды байлайтын рецепторды экспресс жасайды. Аптоздық жасушалар анықталғаннан кейін алынып тасталады.

А5 қосымшасымен жасуша өлімін анықтау

Аптоздың жеке, сау жасушалары фагоциттермен тез жойылады. Алайда патологиялық процестер кезінде апоптоздық жасушалардың алынуы кешіктірілуі немесе тіпті болмауы мүмкін. Тіндердің өліп бара жатқан жасушаларын А5 аннексинімен анықтауға болады. Анексин А5 флуоресцентті немесе радиоактивті молекулалармен таңбалау, таңбаланған Анексин А5 клетканың жасуша бетінде апоптоздық жасушаларға байлануын анықтауға мүмкіндік береді. Фосфолипидтер бетіне байланғаннан кейін А5 аннексині тримерлік кластерге жиналады. Бұл тример А5 аннексинінің үш молекуласынан тұрады, олар бір- біріне ковалентті емес ақуыз- ақуыз өзара әрекеттесуі арқылы байланысады. Анексин А5 тримерлерінің пайда болуы фосфолипид мембранасында екі өлшемді кристалдық тордың пайда болуына әкеледі. Анексин А5 мембранаға топталғанда, флуоресценттік немесе радиоактивті зондпен таңбаланған кезде Анексин А5 интенсивтілігі айтарлықтай артады. Егер екі өлшемді кристалл түзілуі жасуша өлімінің бастапқы кезеңінде болатын жасушаларда пайда болса, онда эндоцитоздың жаңа процесі арқылы А5 аннексинінің интернализациясына себеп болады деп есептеледі. Интернализация қосымша А5 анексинді боялған жасушаның интенсивтілігін күшейтеді. Анексин А5 апоптоздық жасушаларды in vitro және in vivo кезең-кезеңмен анықтау үшін қолданылды. Апоптоз пайда болатын патологиялық процестерге қабыну, миокард инфарктынан жүректің ишемиялық зақымдануы, қан тамырларының атеросклероздық плакаттарында орналасқан апоптоздық ақ қан клеткалары мен тегіс бұлшық еттер клеткалары, донордың иммундық жүйесімен кері қайтарылған трансплантацияланған мүшелері немесе химиотерапия кезінде цитостатикалық препараттарға ұшыраған ісіктік жасушалар жатады. Ауру тіндерді инвазивті емес анықтау, мысалы, радиоактивті белгісі бар А5 аннексині - бұл молекулалық бейнелеу деп аталатын жаңадан әзірленген зерттеу бағытының мақсаты. Радиоактивті А5 аннексинін қолдана отырып, жасуша өлімінің молекулалық бейнелеуі атеросклероздық плакалардың (тұрақсыз атеросклероз) осалдық диагнозын қою, жүрек жетіспеушілігі, трансплантацияның кері қайтарылуы және қатерлі ісікке қарсы терапияның тиімділігін бақылау үшін клиникалық мәнге ие болуы мүмкін.

Healthy individual apoptotic cells are rapidly removed by phagocytes. However, in pathological processes, the removal of apoptotic cells may be delayed or even absent. Dying cells in tissue can be detected with annexin A5. Labeling of annexin A5 with fluorescent or radioactive molecules makes it possible to detect binding of labeled annexin A5 to the cell surface of apoptotic cells. After binding to the phospholipid surface, annexin A5 assembles into a trimeric cluster. This trimer consists of three annexin A5 molecules that are bound to each other via non covalent protein protein interactions. The formation of annexin A5 trimers results in the formation of a two dimensional crystal lattice on the phospholipid membrane. This clustering of annexin A5 on the membrane greatly increases the intensity of annexin A5 when labeled with a fluorescent or radioactive probe. Two dimensional crystal formation is believed to cause internalization of annexin A5 through a novel process of endocytosis if it occurs on cells that are in the early phase of executing cell death. Internalization amplifies additionally the intensity of the annexin A5 stained cell. Annexin A5 has been used to successively detect apoptotic cells in vitro and in vivo. Pathological processes in which apoptosis occurs include inflammation, ischemia damage of the heart caused by myocardial infarction, apoptotic white blood cells and smooth muscle cells present in atherosclerotic plaques of blood vessels, transplanted organs in the donor patient that are rejected by the immune system or tumour cells that are exposed to cytostatic drugs during chemotherapy. The non invasive detection of diseased tissue with, for example, radioactively labeled annexin A5 is the goal of a recently developed line of research known as Molecular Imaging. Molecular Imaging of cell death using radioactive annexin A5 can become of clinical significance to diagnose vulnerability of atherosclerotic plaques (unstable atherosclerosis), heart failure, transplant rejection, and to monitor efficacy of anti cancer therapy.