Annexin A5 affinity assay

Введение

В молекулярной биологии, анализ аффинности аннексина А5 - это тест для количественного определения количества клеток, подвергающихся апоптозу. Для маркировки апоптотических и мертвых клеток в анализе используется белок анексин А5, а затем количество клеток подсчитывается с помощью поточной цитометрии или флуоресцентного микроскопа. Белок анексина а5 связывается с апоптотическими клетками в зависимости от кальция с помощью мембранных поверхностей, содержащих фосфатидилсерин, которые обычно присутствуют только на внутренней оболочке мембраны.

Предыстория

Апоптоз - это форма запрограммированной гибели клеток, которую организм использует для удаления нежелательных, поврежденных или стареющих клеток из тканей. Удаление апоптотических клеток осуществляется посредством фагоцитоза белыми кровяными клетками, такими как макрофаги и дендритные клетки. Фагоцитарные белые кровяные клетки распознают апоптотические клетки по их воздействию на отрицательно заряженные фосфолипиды (фосфатидилсерин) на поверхности клетки. В нормальных клетках отрицательные фосфолипиды находятся на внутренней стороне клеточной мембраны, в то время как внешняя поверхность мембраны занята незаряженными фосфолипидами. После того, как клетка вступила в апоптоз, отрицательно заряженные фосфолипиды транспортируются на внешнюю поверхность клетки гипотетическим белком, известным как скремблаза. Фагоцитарные белые кровяные клетки экспрессируют рецептор, который может связываться и обнаруживать отрицательно заряженные фосфолипиды на поверхностях апоптотических клеток. После обнаружения апоптотических клеток удаляют.

Обнаружение гибели клеток при помощи аннексина А5

Здоровые отдельные апоптотические клетки быстро удаляются фагоцитами. Однако в патологических процессах удаление апоптотических клеток может быть замедлено или даже отсутствовать. Смертельные клетки в тканях могут быть обнаружены при помощи аннексина А5. Маркировка аннексина А5 флуоресцентными или радиоактивными молекулами позволяет обнаружить связывание маркированного аннексина А5 с клеточной поверхностью апоптотических клеток. После связывания с поверхностью фосфолипидов, аннексин А5 собирается в тримерный кластер. Этот тример состоит из трех молекул аннексина А5, которые связаны друг с другом посредством нековалентных белковых белковых взаимодействий. Формирование тримеров аннексина А5 приводит к образованию двумерной кристаллической решетки на фосфолипидной мембране. Такое скопление аннексина А5 на мембране значительно увеличивает интенсивность аннексина А5, когда маркируется флуоресцентным или радиоактивным зондом. Считается, что двумерное кристаллическое образование вызывает интернализацию анексина А5 посредством нового процесса эндоцитоза, если оно происходит на клетках, находящихся на ранней фазе выполнения клеточной смерти. Интернализация дополнительно усиливает интенсивность окрашенной клетки анексина А5. Аннексин А5 использовался для последовательного обнаружения апоптотических клеток in vitro и in vivo. Патологические процессы, при которых происходит апоптоз, включают воспаление, ишемическое повреждение сердца, вызванное инфарктом миокарда, апоптотические белые кровяные клетки и гладкие мышечные клетки, присутствующие в атеросклеротических бляшках кровеносных сосудов, пересаженные органы у пациента- донора, которые отторгаются иммунной системой, или опухолевые клетки, подверженные воздействию цитостатических препаратов во время химиотерапии. Неинвазивное обнаружение больных тканей, например, радиоактивно маркированным анексином А5, является целью недавно разработанной линии исследований, известной как молекулярная визуализация. Молекулярная визуализация гибели клеток с использованием радиоактивного анексина А5 может иметь клиническое значение для диагностики уязвимости атеросклеротических бляшек (нестабильный атеросклероз), сердечной недостаточности, отторжения трансплантата и для мониторинга эффективности противораковой терапии.

Healthy individual apoptotic cells are rapidly removed by phagocytes. However, in pathological processes, the removal of apoptotic cells may be delayed or even absent. Dying cells in tissue can be detected with annexin A5. Labeling of annexin A5 with fluorescent or radioactive molecules makes it possible to detect binding of labeled annexin A5 to the cell surface of apoptotic cells. After binding to the phospholipid surface, annexin A5 assembles into a trimeric cluster. This trimer consists of three annexin A5 molecules that are bound to each other via non covalent protein protein interactions. The formation of annexin A5 trimers results in the formation of a two dimensional crystal lattice on the phospholipid membrane. This clustering of annexin A5 on the membrane greatly increases the intensity of annexin A5 when labeled with a fluorescent or radioactive probe. Two dimensional crystal formation is believed to cause internalization of annexin A5 through a novel process of endocytosis if it occurs on cells that are in the early phase of executing cell death. Internalization amplifies additionally the intensity of the annexin A5 stained cell. Annexin A5 has been used to successively detect apoptotic cells in vitro and in vivo. Pathological processes in which apoptosis occurs include inflammation, ischemia damage of the heart caused by myocardial infarction, apoptotic white blood cells and smooth muscle cells present in atherosclerotic plaques of blood vessels, transplanted organs in the donor patient that are rejected by the immune system or tumour cells that are exposed to cytostatic drugs during chemotherapy. The non invasive detection of diseased tissue with, for example, radioactively labeled annexin A5 is the goal of a recently developed line of research known as Molecular Imaging. Molecular Imaging of cell death using radioactive annexin A5 can become of clinical significance to diagnose vulnerability of atherosclerotic plaques (unstable atherosclerosis), heart failure, transplant rejection, and to monitor efficacy of anti cancer therapy.