Калмодулин: кальций байланыстырушы хабаршы протеин

Кіріспе

Мессенджерлік ақуыз

Кальмодулин (CaM) (кальциймен модуляцияланатын ақуыздың аббревиатурасы) – барлық эукариоттық жасушаларда кездесетін көп функциялы, аралық кальций байланыстыратын мессенджерлік ақуыз. Ол екіншілік мессенджер Ca2+ -нің жасуша ішіндегі мақсаты болып табылады, ал кальмодулиннің белсендірілуі үшін Ca2+ байланысуы қажет. Ca2+ байланысқаннан кейін кальмодулин, кинезалар немесе фосфатазалар сияқты әртүрлі мақсатты ақуыздармен өзара әрекеттесуін өзгерту арқылы кальций сигналдарын жеткізу жолының бір бөлігі ретінде әрекет етеді.

Құрылымы

Кальмодулин – 148 аминқышқылынан (16,7 кДа) тұратын шағын, жоғары сақталған белок. Белокта екі шамамен симметриялық шар тәрізді домен (N және C домендері) бар, олардың әрқайсысы икемді байланыстырушы аймақпен бөлінген EF қол мотивтерінің жұбын қамтиды, барлығы төрт Ca2+ байланысу орыны, әр шар тәрізді доменде екеуі. Ca2+ бос күйде, төрт EF қолды құрайтын спиральдар тығыз күйде жиырылады, ал орталық байланыстырушы ретсіз болады; Ca2+ қаныққан күйде EF қол спиральдары бір-біріне шамамен перпендикуляр ашық күйге өтеді, ал орталық байланыстырушы кристалдық құрылымда кеңейтілген альфа спираль құрайды. C доменінің Ca2+ үшін байланысу қабілеті N доменінен жоғары. Кальмодулин құрылымдық жағынан төрт EF қол мотиві бар тағы бір Ca2+ байланыстыратын белок – тропонин C-ге өте ұқсас. Дегенмен, тропонин C өзінің N ұшында қосымша альфа спиральға ие және оның мақсаты – тропонин I-ге тұрақты түрде байланысады. Сондықтан ол кальмодулинге тән мақсатты танудың әртүрлілігін көрсетпейді.

Кальмодулиннің икемділігінің маңызы

Кальмодулиннің өте көп түрлі мақсаттық белоктарды тану қабілеті, көбінесе оның құрылымдық икемділігіне байланысты. Орталық линкер доменінің икемділігімен қатар, N және C домендері Ca2+ байланысқан күйде ашылу-жабылу конформациялық циклдерін бастан кешіреді. Бұған қоса, кальмодулин мен көптеген мақсаттық белоктары арасындағы байланыстың басым гидрофобтық табиғаты, мақсаттық белок тізбектерінің кең спектрін тануға мүмкіндік береді. Осы мүмкіндіктердің жиынтығы кальмодулинге CaM байланысу тізбек мотивтерінің әртүрлілігін көрсететін шамамен 300 мақсаттық белокты тануға мүмкіндік береді.

Механизм

EF қолдарымен Ca2+ байланысуы N және C домендерінің ашылуына себеп болады, бұл гидрофобтық нысаналық байланыс беттерін ашады, нәтижесінде нысаналық белоктың функциясында өзгерістерге әкеледі. Кальмодулиннің кальциймен байланысуы айқын кооперативтілік көрсетеді, бұл Ca2+ және нысаналық байланыс өзара әрекеттесулері арасындағы күрделі аллостериялық байланысқа мүмкіндік береді. Нысаналық байланыстың Ca2+ туындылығына тигізетін әсері, мысалы, кішкентай өткізгіштігі бар Ca2+ белсенді калий (SK) арналары сияқты, кальмодулинмен тұрақты байланысқан белоктардың Ca2+ арқылы белсендірілуіне мүмкіндік береді деп саналады. Кальмодулин негізінен Ca2+ байланыстыратын белок ретінде жұмыс істесе де, басқа металл иондарын да координациялайды. Мысалы, Mg2+ (0.5–1.0 мМ) мөлшеріндегі жасуша ішіндегі қалыпты концентрациясы және Ca2+ (100 нМ) демалыс концентрациясы болғанда, кальмодулиннің Ca2+ байланыс орындары кем дегенде жартылай Mg2+ арқылы қанықтырылады. Бұл Mg2+ сигналдық оқиғалардың нәтижесінде пайда болатын Ca2+ жоғары концентрациясымен ығыстырылады. Сол сияқты, Ca2+ өзі басқа металл иондарымен, мысалы, кальмодулиннің байланыс қалталарымен Ca2+ -дан да күшті байланысатын үш валентті лантаноидтармен алмастырылуы мүмкін. Мұндай иондар кальмодулиннің құрылымын бұрмалайды және олардың in vivo сирек кездесуіне байланысты әдетте физиологиялық маңызы жоқ, бірақ олар кальмодулиннің құрылымы мен функциясын баяндау үшін ғылыми зерттеулерде кеңінен қолданылады. Кальций жасуша ішіндегі сигнал беру жүйесіне бастапқы стимулға жауап ретінде таралмалы екінші хабаршы ретінде қатысады. Ол жасушадағы әртүрлі нысаналарға, соның ішінде көптеген ферменттерге, иондық арналарға, аквапориндерге және басқа белоктарға байланысу арқылы осы қызметті атқарады. Тегіс бұлшық еттің жиырылуын белсендіру үшін миозин жеңіл тізбегінің басы фосфорилденуі керек. Бұл фосфорилдеу миозин жеңіл тізбегі (МЖЖ) киназасымен жүзеге асырылады. Бұл MLC киназа кальциймен байланысқан кальмодулинмен белсендіріледі, осылайша тегіс бұлшық еттің жиырылуы кальцийдің болуына, кальмодулиннің байланысуына және MLC киназаның белсендірілуіне байланысты болады. Кальций сорғылары цитоплазмадан кальцийді шығарып тастайды немесе оны эндоплазмалық ретикулумда сақтайды, бұл бақылау көптеген төменгі ағыстағы процестерді реттеуге көмектеседі. Бұл кальмодулиннің өте маңызды функциясы, өйткені ол тегіс бұлшық еттің жиырылуына байланысты, мысалы, ас қорыту және артериялардың жиырылуы (қан ағынының таралуына және қан қысымын реттеуге көмектеседі) сияқты барлық физиологиялық процестерге жанама түрде әсер етеді.

Binding of Ca2+ by the EF hands causes an opening of the N and C domains, which exposes hydrophobic target binding surfaces. leading to changes in the target protein's function. Calcium binding by calmodulin exhibits considerable cooperativity, which allows for complex allosteric interplay between Ca2+ and target binding interactions. This influence of target binding on Ca2+ affinity is believed to allow for Ca2+ activation of proteins that are constitutively bound to calmodulin, such as small conductance Ca2+ activated potassium (SK) channels. Although calmodulin principally operates as a Ca2+ binding protein, it also coordinates other metal ions. For example, in the presence of typical intracellular concentrations of Mg2+ (0.5–1.0 mM) and resting concentrations of Ca2+ (100 nM), calmodulin's Ca2+ binding sites are at least partially saturated by Mg2+. This Mg2+ is displaced by the higher concentrations of Ca2+ generated by signaling events. Similarly, Ca2+ may itself be displaced by other metal ions, such as the trivalent lanthanides, that associate with calmodulin's binding pockets even more strongly than Ca2+. Though such ions distort calmodulin's structure and are generally not physiologically relevant due to their scarcity in vivo, they have nonetheless seen wide scientific use as reporters of calmodulin structure and function. Calcium participates in an intracellular signaling system by acting as a diffusible second messenger to the initial stimuli. It does this by binding various targets in the cell including a large number of enzymes, ion channels, aquaporins and other proteins. In order to activate contraction of smooth muscle, the head of the myosin light chain must be phosphorylated. This phosphorylation is done by myosin light chain (MLC) kinase. This MLC kinase is activated by a calmodulin when it is bound by calcium, thus making smooth muscle contraction dependent on the presence of calcium, through the binding of calmodulin and activation of MLC kinase. Calcium pumps take calcium out of the cytoplasm or store it in the endoplasmic reticulum and this control helps regulate many downstream processes. This is a very important function of calmodulin because it indirectly plays a role in every physiological process that is affected by smooth muscle contraction such as digestion and contraction of arteries (which helps distribute blood and regulate blood pressure).

Зат алмасудағы рөлі

Кальмодулин фосфорилаза киназасының белсендірілуінде маңызды рөл атқарады, бұл әрі қарай глюкозаның гликоген фосфорилазасы арқылы гликогеннен бөлінуіне алып келеді. Кальмодулин кальцитонинге әсер ету арқылы липидтер метаболизмінде де маңызды рөл атқарады. Кальцитонин – қандағы Ca2+ деңгейін төмендететін және cAMP пайда болуына әкелетін Gs протеин каскадтарын белсендіретін полипептид гормоны. Кальмодулиннің әсерін тежеу арқылы кальцитониннің әсерін тоқтатуға болады, бұл кальмодулиннің кальцитониннің белсендірілуінде шешуші рөл атқаратынын көрсетеді. Сонымен қатар, зерттеулер CaMKII-ді тежеудің ұзақ мерзімді потенцияцияға (LTP) кедергі келтіретінін көрсетіп тұр. Кальмодулиндер өсімдіктердің дамуында және қоршаған ортаның факторларына бейімделуінде маңызды рөл атқарады. Кальций жасуша қабырғасының және жасуша мембранасының құрылымдық тұрақтылығында маңызды рөл атқарады. Дегенмен, кальцийдің жоғары деңгейі өсімдіктің жасушалық энергия алмасуына зиян келтіруі мүмкін, сондықтан цитозольдегі Ca2+ концентрациясы цитозольдік Ca2+-ды апопластқа немесе жасуша ішіндегі органеллалардың люменіне шығару арқылы субмикромолярлық деңгейде ұсталып тұрады. Қосымша ағын мен шығудың нәтижесінде пайда болатын Ca2+ импульстары гормондар, жарық, гравитация, абиотикалық стресс факторлары және патогендермен өзара әрекеттесу сияқты сыртқы стимулдарға жауап ретінде жасушалық сигналдар ретінде әрекет етеді.

CML (CaM-мен байланысты ақуыздар)

Өсімдіктерде CaM-мен байланысты белоктар (CML) CaM-нің қалыпты белоктарынан өзгеше болып табылады. CML-дер қалыпты CaM-мен шамамен 15% аминқышқылдық ұқсастыққа ие. Арабидопсис талианада 50-ге жуық әртүрлі CML гендері кездеседі, бұл осы әртүрлі белдіктердің жасушалық функцияда қандай мақсатқа қызмет ететінін сұраққа жетелейді. Барлық өсімдік түрлері CML гендерінің осы әртүрлілігін көрсетеді. Әртүрлі CaM және CML-дер in vivo CaM-мен реттелетін ферменттерге байланысу және оларды белсендіру қабілеті бойынша ерекшеленеді. CaM немесе CML-дер әртүрлі органелла бөлімшелерінде орналасқандығы анықталды.

Өсімдіктердің өсуі мен дамуы

Арабидопсисте DWF1 ақуызы өсімдіктерге қажетті стероид гормондары – брассиностероидтердің биосинтезінде ферменттік рөл атқарады. CaM және DWF1 арасында өзара әрекеттесу болады, ал DWF1 CaM-ға байланыса алмайтындықтан, өсімдіктерде қалыпты өсу фенотипі байқалмайды. Осылайша, CaM өсімдік өсуіндегі DWF1 функциясы үшін маңызды. CaM байланыстыратын ақуыздар өсімдіктерде репродуктивті дамуды реттеуге де қатысады. Мысалы, темекідегі CaM байланыстыратын киназа гүлденудің теріс реттеушісі болып табылады. Дегенмен, бұл CaM байланыстыратын киназалар темекінің апикалық меристемасында да кездеседі, және меристемадағы осы киназалардың жоғары концентрациясы өсімдікте гүлденуге кешігуді тудырады. S локустық рецептор киназасы (SRK) – CaM-мен өзара әрекеттесетін тағы бір белок киназасы. SRK брассикадағы тозаң-аналық өзара әрекеттесуіне қатысты өз-өзіне үйлеспеушілік реакцияларына қатысады. Арабидопсистегі CaM нысаналары тозаңның дамуы мен ұрықтандыруға да қатысады. Ca2+ тасымалдаушылар тозаң түтігінің өсуі үшін маңызды. Сондықтан, ұрықтандыру процесінде ұзын созылу үшін тозаң түтігінің ұшында тұрақты Ca2+ градиенті сақталады. Сол сияқты, CaM да тозаң түтігінің ұшында маңызды, онда оның басты рөлі тозаң түтігінің өсуін бағыттауды қамтиды.

Тозықтың пайда болуы

Ca2+ бұршақ тұқымдас өсімдіктерде түйіндіктердің қалыптасуында маңызды рөл атқарады. Азот – өсімдіктерге қажетті маңызды элемент, ал көптеген бұршақ тұқымдастар азотты өздігінен бекіте алмай, азотты аммиакқа дейін тотықтыратын азотты бекітетін бактериялармен симбиозға түседі. Бұл бұршақ-ризобиумдық өзара әрекеттің орналуы үшін ризобиум бактериясы шығаратын Nod факторы қажет. Nod факторы бұршақ тұқымдас өсімдіктерде түйіндіктердің қалыптасуына қатысатын тамыр түктерінің жасушаларымен танылады. Әртүрлі сипаттағы Ca2+ жауаптары Nod факторын тануға қатысты екені анықталды. Алдымен тамыр түктерінің ұшында Ca2+ ағыны байқалады, содан кейін цитозольде Ca2+ кезектесіп тербелісі және ядроның маңында Ca2+ шығыры байқалады. Ca2+ тербелісінің белгісінен кейін жұмыс істейтін және Nod факторының сигналдарын жеткізуге қатысатын маңызды DMI3 гені, Ca2+ белгісін тануы мүмкін. Сонымен қатар, Medicago және Lotus-тың бірнеше CaM және CML гендері түйіндіктерде экспрессияланады.

Патогенді қорғау

Өсімдіктердің патогендерге қарсы қолданатын қорғаныс стратегияларының алуан түрлілігі арасында Ca2+ сигнализациясы кең таралған. Патогендік инфекцияға жауап ретінде цитоплазмадағы бос Ca2+ деңгейі артады. Осы сипаттағы Ca2+ сигнатуралары әдетте, қорғанысқа қатысты гендерді және гиперсезімтал жасуша өлімін тудыру арқылы өсімдіктердің қорғаныс жүйесін белсендіреді. CaM, CML және CaM байланыстыратын ақуыздар – өсімдіктердің қорғаныс сигналдық жолдарының жақында анықталған элементтерінің бір бөлігі. Темекі, бұршақ және помидордағы бірнеше CML гендері патогендерге сезімтал. CML43 – CaM-мен байланысты белок, ол ауруға төзімді Arabidopsis жапырақтарынан алынған APR134 генінен гендік экспрессияны талдау үшін оқшауланды. Pseudomonas syringae жапырақтарға егілген кезде ол тез индукцияланады. Бұл гендер помидорда (Solanum lycopersicum) да табылады. APR134-тен алынған CML43 in vitro жағдайында Ca2+ иондарымен байланысады, бұл CML43 және APR134 бактериялық патогендерге қарсы өсімдік иммундық жауабы кезінде Ca2+ тәуелді сигнализацияға қатысатынын көрсетеді. Arabidopsis thaliana-да CML9 экспрессиясы фитопатогенді бактериялар, флагеллин және салицил қышқылымен тез индукцияланады. Трансгендік темекі мен Arabidopsis-те соя SCaM4 және SCaM5 экспрессиясы патогенге төзімділікке қатысты гендердің белсендірілуіне және патогендік инфекцияның кең спектріне қарсы күшейтілген төзімділікке әкеледі. Бұл сояның жоғары сақталған CaM изоформалары SCaM1 және SCaM2 үшін дұрыс емес. AtBAG6 ақуызы – CaM-мен байланысатын ақуыз, ол тек Ca2+ болмағанда ғана CaM-мен байланысады, ал Ca2+ болғанда жоқ. AtBAG6 патогендік инфекцияның таралуын болдырмау немесе патогеннің өсуін шектеу үшін бағдарламаланған жасуша өлімінің гиперсезімталдық реакциясына жауап береді. CaM байланыстыратын ақуыздардың мутациялары өсімдіктердің патогендік инфекцияларға қарсы қорғаныс жауабына елеулі әсер етуі мүмкін. Циклдік нуклеотидтік қақпалы каналдар (CNGC) – плазмалық мембранадағы функционалдық ақуыз каналдары, олар Ca2+ сияқты дивалентті катиондарды тасымалдауға қабілетті және CaM байланысу орындарымен жапсарлы. Алайда, өсімдік қорғанысы үшін бұл жолдағы CNGC-тің орналасуының нақты рөлі әлі анықталған жоқ.

Among the diverse range of defense strategies plants utilize against pathogens, Ca2+ signaling is very common. Free Ca2+ levels in the cytoplasm increases in response to a pathogenic infection. Ca2+ signatures of this nature usually activate the plant defense system by inducing defense related genes and the hypersensitive cell death. CaMs, CMLs and CaM binding proteins are some of the recently identified elements of the plant defense signaling pathways. Several CML genes in tobacco, bean and tomato are responsive to pathogens. CML43 is a CaM related protein that, as isolated from APR134 gene in the disease resistant leaves of Arabidopsis for gene expression analysis, is rapidly induced when the leaves are inoculated with Pseudomonas syringae. These genes are also found in tomatoes (Solanum lycopersicum). The CML43 from the APR134 also binds to Ca2+ ions in vitro which shows that CML43 and APR134 are, hence, involved in the Ca2+ dependent signaling during the plant immune response to bacterial pathogens. The CML9 expression in Arabidopsis thaliana is rapidly induced by phytopathogenic bacteria, flagellin and salicylic acid. Expression of soybean SCaM4 and SCaM5 in transgenic tobacco and Arabidopsis causes an activation of genes related to pathogen resistance and also results in enhanced resistance to a wide spectrum of pathogen infection. The same is not true for soybean SCaM1 and SCaM2 that are highly conserved CaM isoforms. The AtBAG6 protein is a CaM binding protein that binds to CaM only in the absence of Ca2+ and not in the presence of it. AtBAG6 is responsible for the hypersensitive response of programmed cell death in order to prevent the spread of pathogen infection or to restrict pathogen growth. Mutations in the CaM binding proteins can lead to severe effects on the defense response of the plants towards pathogen infections. Cyclic nucleotide gated channels (CNGCs) are functional protein channels in the plasma membrane that have overlapping CaM binding sites transport divalent cations such as Ca2+. However, the exact role of the positioning of the CNGCs in this pathway for plant defense is still unclear.

Өсімдіктердегі абиотикалық стресске жауап

Жасуша ішіндегі Ca2+ деңгейінің өзгеруі механикалық әсерлерге, осмостық және тұздық емдеулерге, сондай-ақ суық және жылулық соққыларға жауап ретіндегі әртүрлі реакциялардың көрсеткіші ретінде қолданылады. Түбір жасушаларының әртүрлі типтері осмостық және тұздық стресске әртүрлі Ca2+ жауабын көрсетеді, бұл Ca2+ үлгілерінің жасушалық ерекшеліктерін көрсетеді. Сыртқы стресске жауап ретінде CaM глутаматты ГАМҚ-ға айналдыратын глутамат декарбоксилазасын (GAD) белсендіреді. ГАМҚ синтезін қатаң бақылау өсімдік дамуы үшін маңызды, сондықтан ГАМҚ деңгейінің артуы өсімдік дамуына елеулі әсер етуі мүмкін. Осылайша, сыртқы стресс өсімдіктердің өсуі мен дамуына әсер етеді және CaM осы әсерді бақылайтын процесте қатысады.

Сорго

Сорго өсімдігі – жақсы зерттелген үлгілік организм және ыстық әрі құрғақ ортаға бейімделе алады. Сондықтан, ол өсімдіктерде кальмодулиннің қызметін зерттеу үшін үлгі ретінде пайдаланылады. Өсімдікті түрлі стрестік жағдайларға ұшырату арқылы, қоршаған орта өзгерістеріне төзімділікті қамтамасыз ететін әртүрлі белоктардың өндірілуі тежелуі мүмкін. Бұл өзгертілген стрестік белоктар CaM-мен өзара әрекеттеседі. Соргода экспрессияланатын CaMBP гендері, ыстық пен құрғақшылық стрессіне төзімділікті зерттеу үшін "үлгілі егіс дақылы" ретінде қарастырылады.

Арабидопсис

Арабидопсис талиана зерттеуінде жүздеген түрлі ақуыздар өсімдіктерде CaM-мен байланыса алатыны анықталды.

Басқа кальцийді байлайтын ақуыздар

Кальмодулин кальцийді байланыстыратын ақуыздардың екі негізгі тобының біріне жатады, бұл топ EF-қол ақуыздары деп аталады. Екінші топ, анексиндер, кальцийді және липокортин сияқты фосфолипидтерді байланыстырады. Көптеген басқа ақуыздар да кальцийді байланыстырады, бірақ кальцийді байланыстыру олардың жасушадағы басты функциясы болып есептелмейді.