Кальмодулин: белок-посредник кальциевой сигнализации.

Введение

Протеин-мессенджер

Кальмодулин (CaM) (аббревиатура от calcium modulated protein) — многофункциональный промежуточный белок-мессенджер, связывающий кальций, который экспрессируется во всех эукариотических клетках. Он является внутриклеточной мишенью вторичного мессенджера Ca2+, и связывание Ca2+ необходимо для активации кальмодулина. После связывания с Ca2+, кальмодулин участвует в кальциевом сигнальном пути, изменяя взаимодействие с различными белками-мишенями, такими как киназы или фосфатазы.

Структура

Кальмодулин – это небольшой, высококонсервативный белок длиной 148 аминокислот (16,7 кДа). Белок состоит из двух приблизительно симметричных глобулярных доменов (N- и C-доменов), каждый из которых содержит пару EF-hand мотивов, разделенных гибкой линкерной областью, что обеспечивает в общей сложности четыре сайта связывания Ca2+ – по два в каждом глобулярном домене. В состоянии, свободном от Ca2+, спирали, формирующие четыре EF-hand мотива, свернуты в компактную конформацию, а центральный линкер является неупорядоченным. В состоянии, насыщенном Ca2+, спирали EF-hand мотивов принимают открытую ориентацию, приблизительно перпендикулярную друг другу, а центральный линкер формирует удлиненную альфа-спираль в кристаллической структуре. C-домен обладает более высоким сродством к Ca2+, чем N-домен. По структуре кальмодулин очень похож на тропонин C, другой белок, связывающий Ca2+, также содержащий четыре EF-hand мотива. Однако тропонин C содержит дополнительную альфа-спираль на N-конце и конститутивно связан со своей мишенью – тропонином I. В связи с этим он не проявляет такого разнообразия в распознавании мишеней, как кальмодулин.

Важность гибкости в кальмодулине

Способность кальмодулина распознавать огромный спектр целевых белков во многом обусловлена его структурной гибкостью. Помимо гибкости центрального линкерного домена, N- и C-домены претерпевают конформационные переходы между открытым и закрытым состояниями при связывании с Ca2+. Более того, преимущественно гидрофобный характер взаимодействия между кальмодулином и большинством его мишеней обеспечивает распознавание широкого разнообразия аминокислотных последовательностей белков-мишеней. В совокупности эти особенности позволяют кальмодулину распознавать около 300 белков-мишеней, содержащих различные мотивы связывания с CaM.

Механизм

Связывание Ca2+ EF-руками вызывает раскрытие N- и C-доменов, что обнажает гидрофобные поверхности связывания мишеней, приводя к изменениям в функции белка-мишени. Связывание кальция с кальмодулином характеризуется значительной кооперативностью, что обеспечивает сложное аллостерическое взаимодействие между Ca2+ и взаимодействиями со связывающими мишенями. Считается, что влияние связывания мишени на аффинность к Ca2+ позволяет активировать Ca2+ белки, конститутивно связанные с кальмодулином, такие как калийные каналы с малой проводимостью, активируемые Ca2+ (SK-каналы). Хотя кальмодулин в основном функционирует как белок, связывающий Ca2+, он также координирует другие ионы металлов. Например, при типичных внутриклеточных концентрациях Mg2+ (0,5–1,0 мМ) и концентрациях Ca2+ в состоянии покоя (100 нМ), сайты связывания Ca2+ в кальмодулине по крайней мере частично насыщены Mg2+. Этот Mg2+ вытесняется более высокими концентрациями Ca2+, генерируемыми сигнальными событиями. Аналогично, Ca2+ может быть вытеснен другими ионами металлов, такими как тривалентные лантаноиды, которые связываются с карманами связывания кальмодулина даже прочнее, чем Ca2+. Хотя такие ионы искажают структуру кальмодулина и обычно не имеют физиологического значения из-за их низкой концентрации in vivo, они тем не менее широко используются в научных исследованиях в качестве индикаторов структуры и функции кальмодулина. Кальций участвует во внутриклеточной сигнальной системе, действуя как диффузный вторичный посредник в ответ на начальные стимулы. Он осуществляет это, связываясь с различными мишенями в клетке, включая большое количество ферментов, ионных каналов, аквапоринов и других белков. Для активации сокращения гладкой мускулатуры необходимо фосфорилирование головки легкой цепи миозина. Это фосфорилирование катализируется киназой легкой цепи миозина (MLCK). Эта MLCK активируется кальмодулином при связывании с кальцием, что делает сокращение гладкой мускулатуры зависимым от присутствия кальция посредством связывания кальмодулина и активации MLCK. Кальциевые насосы удаляют кальций из цитоплазмы или накапливают его в эндоплазматическом ретикулуме, и этот контроль помогает регулировать многие последующие процессы. Это очень важная функция кальмодулина, поскольку он косвенно участвует в каждом физиологическом процессе, на который влияет сокращение гладкой мускулатуры, например, пищеварение и сокращение артерий (что способствует распределению крови и регулированию кровяного давления).

Binding of Ca2+ by the EF hands causes an opening of the N and C domains, which exposes hydrophobic target binding surfaces. leading to changes in the target protein's function. Calcium binding by calmodulin exhibits considerable cooperativity, which allows for complex allosteric interplay between Ca2+ and target binding interactions. This influence of target binding on Ca2+ affinity is believed to allow for Ca2+ activation of proteins that are constitutively bound to calmodulin, such as small conductance Ca2+ activated potassium (SK) channels. Although calmodulin principally operates as a Ca2+ binding protein, it also coordinates other metal ions. For example, in the presence of typical intracellular concentrations of Mg2+ (0.5–1.0 mM) and resting concentrations of Ca2+ (100 nM), calmodulin's Ca2+ binding sites are at least partially saturated by Mg2+. This Mg2+ is displaced by the higher concentrations of Ca2+ generated by signaling events. Similarly, Ca2+ may itself be displaced by other metal ions, such as the trivalent lanthanides, that associate with calmodulin's binding pockets even more strongly than Ca2+. Though such ions distort calmodulin's structure and are generally not physiologically relevant due to their scarcity in vivo, they have nonetheless seen wide scientific use as reporters of calmodulin structure and function. Calcium participates in an intracellular signaling system by acting as a diffusible second messenger to the initial stimuli. It does this by binding various targets in the cell including a large number of enzymes, ion channels, aquaporins and other proteins. In order to activate contraction of smooth muscle, the head of the myosin light chain must be phosphorylated. This phosphorylation is done by myosin light chain (MLC) kinase. This MLC kinase is activated by a calmodulin when it is bound by calcium, thus making smooth muscle contraction dependent on the presence of calcium, through the binding of calmodulin and activation of MLC kinase. Calcium pumps take calcium out of the cytoplasm or store it in the endoplasmic reticulum and this control helps regulate many downstream processes. This is a very important function of calmodulin because it indirectly plays a role in every physiological process that is affected by smooth muscle contraction such as digestion and contraction of arteries (which helps distribute blood and regulate blood pressure).

Роль в метаболизме

Кальмодулин играет важную роль в активации фосфорилазокиназы, что в конечном итоге приводит к расщеплению глюкозы из гликогена под действием гликогенфосфорилазы. Кальмодулин также играет важную роль в метаболизме липидов, воздействуя на кальцитонин. Кальцитонин – это полипептидный гормон, который снижает уровень Ca2+ в крови и активирует каскады Gs-белка, приводящие к образованию цАМФ. Действие кальцитонина может быть заблокировано ингибированием действия кальмодулина, что указывает на его ключевую роль в активации кальцитонина. Кроме того, исследования показывают, что ингибирование CaMKII нарушает долговременную потенциацию (LTP). Кальмодулины играют важную роль в развитии растений и адаптации к факторам окружающей среды. Кальций играет ключевую роль в структурной целостности клеточной стенки и мембранной системы клетки. Однако высокие уровни кальция могут быть токсичными для клеточного энергетического метаболизма растений, поэтому концентрация Ca2+ в цитозоле поддерживается на субмикромолярном уровне путем удаления цитозольного Ca2+ в апопласт или просвет внутриклеточных органелл. Пульсации Ca2+, возникающие из-за усиления притока и оттока, служат клеточными сигналами в ответ на внешние стимулы, такие как гормоны, свет, гравитация, абиотические стрессовые факторы, а также взаимодействие с патогенами.

CML (белки, связанные с CaM)

Растения содержат белки, связанные с CaM (CML), помимо типичных белков CaM. CML имеют около 15% сходства в аминокислотной последовательности с типичными CaM. Arabidopsis thaliana содержит около 50 различных генов CML, что ставит вопрос о назначении этих разнообразных групп белков в клеточной функции. Такое разнообразие генов CML наблюдается у всех видов растений. Различные CaM и CML отличаются по сродству к связыванию и активации ферментов, регулируемых CaM, in vivo. Также было обнаружено, что CaM или CML локализуются в различных компартментах органелл.

Рост и развитие растений

В Arabidopsis белок DWF1 играет ферментативную роль в биосинтезе брассиностероидов – стероидных гормонов растений, необходимых для роста. Взаимодействие происходит между CaM и DWF1, и DWF1, не способный связываться с CaM, не может обеспечить нормальный фенотип роста у растений. Следовательно, CaM необходим для функции DWF1 в росте растений. Также известно, что белки, связывающие CaM, регулируют репродуктивное развитие растений. Например, киназа, связывающая CaM в табаке, действует как отрицательный регулятор цветения. Однако эти киназы, связывающие CaM, также присутствуют в апикальной меристеме побегов табака, и высокая концентрация этих киназ в меристеме вызывает задержку перехода к цветению у растения. S-локусная рецепторная киназа (SRK) – это еще одна протеинкиназа, взаимодействующая с CaM. SRK участвует в реакциях самонесовместимости, связанных с взаимодействием пыльцы и рыльца пестика у растений рода Brassica. Мишени CaM в Arabidopsis также вовлечены в развитие пыльцы и оплодотворение. Транспортеры Ca2+ необходимы для роста пыльцевой трубки. Таким образом, постоянный градиент Ca2+ поддерживается на вершине пыльцевой трубки для ее удлинения в процессе оплодотворения. Аналогично, CaM также необходим на вершине пыльцевой трубки, где его основная роль заключается в направлении роста пыльцевой трубки.

Образование узелков

Ca2+ играет важную роль в образовании клубеньков у бобовых растений. Азот – незаменимый элемент, необходимый для растений, и многие бобовые, не способные самостоятельно фиксировать азот, вступают в симбиотические отношения с азотфиксирующими бактериями, которые восстанавливают азот до аммиака. Установление этого взаимодействия между бобовыми и ризобиями требует Nod-фактора, производимого бактериями ризобии. Nod-фактор распознается клетками корневых волосков, участвующими в образовании клубеньков у бобовых. Разнообразные реакции Ca2+ характеризуются как участвующие в распознавании Nod-фактора. Вначале наблюдается поток Ca2+ на кончике корневого волоска, за которым следуют повторяющиеся колебания Ca2+ в цитозоле, а также пики Ca2+ вокруг ядра. DMI3, ген, необходимый для сигнализации Nod-фактора, функционирует ниже по течению от сигнатуры Ca2+ и, возможно, распознает эту сигнатуру. Кроме того, несколько генов CaM и CML у Medicago и Lotus экспрессируются в клубеньках.

Защита от патогенов

Среди разнообразных стратегий защиты, которые растения используют против патогенов, кальциевая сигнализация (Ca2+ signaling) является весьма распространенной. Уровень свободного Ca2+ в цитоплазме повышается в ответ на патогенную инфекцию. Такие кальциевые сигнатуры обычно активируют систему защиты растений, индуцируя гены, связанные с защитой, и гиперчувствительную гибель клеток. CaM, CML и белки, связывающие CaM, – некоторые из недавно идентифицированных компонентов сигнальных путей защиты растений. Несколько генов CML в табаке, бобах и помидорах реагируют на патогены. CML43 – это белок, родственный CaM, который, будучи выделенным из гена APR134 в устойчивых к болезням листьях Arabidopsis для анализа экспрессии генов, быстро индуцируется при заражении листьев Pseudomonas syringae. Эти гены также обнаружены в помидорах (Solanum lycopersicum). CML43 из APR134 также связывается с ионами Ca2+ in vitro, что указывает на участие CML43 и APR134 в Ca2+-зависимой сигнализации во время иммунного ответа растения на бактериальные патогены. Экспрессия CML9 в Arabidopsis thaliana быстро индуцируется фитопатогенными бактериями, флагеллином и салициловой кислотой. Экспрессия соевых SCaM4 и SCaM5 в трансгенном табаке и Arabidopsis вызывает активацию генов, связанных с устойчивостью к патогенам, и повышает устойчивость к широкому спектру патогенных инфекций. То же самое не относится к соевым SCaM1 и SCaM2, которые являются высококонсервативными изоформами CaM. Белок AtBAG6 – это белок, связывающий CaM, который связывается с CaM только в отсутствие Ca2+ и не связывается в его присутствии. AtBAG6 отвечает за гиперчувствительный ответ, заключающийся в программируемой гибели клеток, чтобы предотвратить распространение патогенной инфекции или ограничить рост патогена. Мутации в белках, связывающих CaM, могут приводить к серьезным нарушениям защитной реакции растений на патогенные инфекции. Циклические нуклеотидные каналы (CNGC) – это функциональные белковые каналы в плазматической мембране, имеющие перекрывающиеся участки связывания CaM и транспортирующие двухвалентные катионы, такие как Ca2+. Однако точная роль позиционирования CNGC в этом пути защиты растений остается неясной.

Among the diverse range of defense strategies plants utilize against pathogens, Ca2+ signaling is very common. Free Ca2+ levels in the cytoplasm increases in response to a pathogenic infection. Ca2+ signatures of this nature usually activate the plant defense system by inducing defense related genes and the hypersensitive cell death. CaMs, CMLs and CaM binding proteins are some of the recently identified elements of the plant defense signaling pathways. Several CML genes in tobacco, bean and tomato are responsive to pathogens. CML43 is a CaM related protein that, as isolated from APR134 gene in the disease resistant leaves of Arabidopsis for gene expression analysis, is rapidly induced when the leaves are inoculated with Pseudomonas syringae. These genes are also found in tomatoes (Solanum lycopersicum). The CML43 from the APR134 also binds to Ca2+ ions in vitro which shows that CML43 and APR134 are, hence, involved in the Ca2+ dependent signaling during the plant immune response to bacterial pathogens. The CML9 expression in Arabidopsis thaliana is rapidly induced by phytopathogenic bacteria, flagellin and salicylic acid. Expression of soybean SCaM4 and SCaM5 in transgenic tobacco and Arabidopsis causes an activation of genes related to pathogen resistance and also results in enhanced resistance to a wide spectrum of pathogen infection. The same is not true for soybean SCaM1 and SCaM2 that are highly conserved CaM isoforms. The AtBAG6 protein is a CaM binding protein that binds to CaM only in the absence of Ca2+ and not in the presence of it. AtBAG6 is responsible for the hypersensitive response of programmed cell death in order to prevent the spread of pathogen infection or to restrict pathogen growth. Mutations in the CaM binding proteins can lead to severe effects on the defense response of the plants towards pathogen infections. Cyclic nucleotide gated channels (CNGCs) are functional protein channels in the plasma membrane that have overlapping CaM binding sites transport divalent cations such as Ca2+. However, the exact role of the positioning of the CNGCs in this pathway for plant defense is still unclear.

Ответ растений на абиотический стресс

Изменение внутриклеточного уровня Ca2+ используется как сигнатура для разнообразных реакций на механические стимулы, осмотические и солевые воздействия, а также на холод и тепловой шок. Различные типы клеток корня демонстрируют различную Ca2+-реакцию на осмотический и солевой стресс, что указывает на клеточную специфичность Ca2+-сигналов. В ответ на внешний стресс CaM активирует глутаматдекарбоксилазу (GAD), которая катализирует превращение глутамата в ГАМК. Строгий контроль синтеза ГАМК важен для развития растений, и, следовательно, повышенный уровень ГАМК может существенно влиять на развитие растений. Таким образом, внешний стресс может влиять на рост и развитие растений, а CaM участвует в этом пути, контролируя данный эффект.

Сорго

Растение сорго – общепризнанный модельный организм, способный адаптироваться к жарким и засушливым условиям. Благодаря этому оно используется в качестве модели для изучения роли кальмодулина в растениях. Воздействие на растение разнообразных стрессовых факторов может приводить к подавлению экспрессии различных белков, обеспечивающих устойчивость клеток растений к изменениям окружающей среды. Показано, что эти модулированные стрессовые белки взаимодействуют с CaM. Гены CaMBP, экспрессируемые в сорго, рассматриваются как модельный объект для исследования устойчивости к тепловому и засушливому стрессу.

Арабидопсис

В исследовании на Arabidopsis thaliana сотни различных белков показали способность связываться с CaM у растений.

Другие белки, связывающие кальций

Кальмодулин принадлежит к одной из двух основных групп белков, связывающих кальций, называемых белками с EF-руками. Другая группа, называемая аннексинами, связывает кальций и фосфолипиды, такие как липокортины. Многие другие белки связывают кальций, хотя связывание кальция может и не являться их главной функцией в клетке.