Мырыш тәрізді ақуыз құрылымдық мотиві

Кіріспе

Транскрипциялық белоктарда көбінесе кездесетін шағын құрылымдық белок мотивтері. Цинк саусағы – бір немесе бірнеше мырыш ионының (Zn2+) координациясымен сипатталатын, құрылымды тұрақтандыратын шағын белок мотиві. Ол бастапқыда африкалық тырнақты бақаның (Xenopus laevis) IIIA транскрипциялық факторының болжамды құрылымының саусақ тәрізді пішінін сипаттау үшін қолданылған. Дегенмен, ол эукариоттық жасушаларда әртүрлі белок құрылымдарын қамтитыны анықталды. Xenopus laevis TFIIIA-ның құрамында мырыш бар екені және оның функциясы үшін металл қажет екені 1983 жылы көрсетілді. Бұл гендік реттеуші белок үшін мырышқа деген алғашқы қажеттілік, одан кейін Drosophila-дағы Krüppel факторы да осылай болды. Ол көбінесе көп доменді белоктарда металл байланысатын домен ретінде кездеседі. TFIIIA аминқышқылдарының тізбегін анықтау 30 аминқышқылдан тұратын тоғыз тізбекті тізбектерді, соның ішінде цистеин мен гистидиннің екі өзгермейтін жұбын анықтады. Рентгендік сәулелерді сіңірудің кеңейтілген құрылымдық талдауы цинк лигандаларының сәйкестігін растады: екі цистеин және екі гистидин. Осы лигандтардың мырышпен координациясы арқылы қалыптасқан ДНК байланыстыру омыртқасы саусаққа ұқсас болғандықтан, осылай аталды. 1991 және 1993 жылдары шешілген цинк саусақ-ДНК кешендерінің кристалдық құрылымдары цинк саусақтарының ДНК-мен өзара әрекеттесуінің канондық үлгісін көрсетті. Цинк саусағының байланысуы көптеген басқа ДНК байланыстыратын белоктардан ерекшеленеді, олар ДНК-ны қос спиральдың 2 еселенген симметриясы арқылы байланыстырады, ал цинк саусақтары әртүрлі ұзындықтағы нуклеин қышқылы тізбектерін байланыстыру үшін тізбектей байланысады. Цинк саусағы мотивінің модулдік табиғаты ДНК және РНК тізбектерінің көптеген комбинацияларының жоғары туыстық және ерекшелікпен байланысуына мүмкіндік береді, сондықтан ол белгілі бір ДНК тізбектеріне бағытталған және байланыса алатын белокты жасауға өте қолайлы. 1994 жылы жасанды түрде құрастырылған үш саусақты белоктың егесіктің жасушалық желісінде онкогеннің экспрессиясын тоқтатуға қабілетті екені көрсетілді. Әр түрлі эффектторлық домендерге біріктірілген цинк саусақтары, соның ішінде терапиялық маңызы барлары, содан бері жасалды. Олардың байланысу қасиеттері саусақ домендерінің аминқышқылдарының тізбегіне және саусақтар арасындағы байланыстырушыға, сондай-ақ жоғары ретті құрылымдар мен саусақтардың санына байланысты. Znf домендері көбінесе кластерлерде кездеседі, онда саусақтарда әртүрлі байланысу ерекшеліктері болуы мүмкін. Znf мотивтері бір-бірімен байланыссыз бірнеше белок суперавтобасыларында кездеседі, олар тізбек және құрылым бойынша әртүрлі. Олар байланысу режимдерінде айтарлықтай әмбебаптылық көрсетеді, тіпті бір кластың мүшелері арасында (мысалы, кейбіреулері ДНК, ал басқалары белокты байланыстырады), бұл Znf мотивтері арнайы функцияларды дамытқан тұрақты қаңқалар екенін көрсетеді. Мысалы, Znf-ті қамтитын белоктар геннің транскрипциясында, трансляциясында, мРНК тасымалында, цитоскелеттің ұйымдастырылуында, эпителийдің дамуында, жасушалардың жабысуында, белоктың бүктелуінде, хроматиннің қайта құрылуында және мырышты сезуде жұмыс істейді. Цинк байланыстыру мотивтері тұрақты құрылымдар болып табылады және олар нысананы байланыстырғаннан кейін конформациялық өзгерістерге сирек ұшырайды.

Small structural protein motif found mostly in transcriptional proteins

A zinc finger is a small protein structural motif that is characterized by the coordination of one or more zinc ions (Zn2+) which stabilizes the fold. It was originally coined to describe the finger like appearance of a hypothesized structure from the African clawed frog (Xenopus laevis) transcription factor IIIA. However, it has been found to encompass a wide variety of differing protein structures in eukaryotic cells. Xenopus laevis TFIIIA was originally demonstrated to contain zinc and require the metal for function in 1983, the first such reported zinc requirement for a gene regulatory protein followed soon thereafter by the Krüppel factor in Drosophila. It often appears as a metal binding domain in multi domain proteins. Amino acid sequencing of TFIIIA revealed nine tandem sequences of 30 amino acids, including two invariant pairs of cysteine and histidine residues. Extended x ray absorption fine structure confirmed the identity of the zinc ligands: two cysteines and two histidines. The DNA binding loop formed by the coordination of these ligands by zinc were thought to resemble fingers, hence the name. The crystal structures of zinc finger DNA complexes solved in 1991 and 1993 revealed the canonical pattern of interactions of zinc fingers with DNA. The binding of zinc finger is found to be distinct from many other DNA binding proteins that bind DNA through the 2 fold symmetry of the double helix, instead zinc fingers are linked linearly in tandem to bind nucleic acid sequences of varying lengths. The modular nature of the zinc finger motif allows for a large number of combinations of DNA and RNA sequences to be bound with high degree of affinity and specificity, and is therefore ideally suited for engineering protein that can be targeted to and bind specific DNA sequences. In 1994, it was shown that an artificially constructed three finger protein can block the expression of an oncogene in a mouse cell line. Zinc fingers fused to various other effector domains, some with therapeutic significance, have since been constructed. Their binding properties depend on the amino acid sequence of the finger domains and on the linker between fingers, as well as on the higher order structures and the number of fingers. Znf domains are often found in clusters, where fingers can have different binding specificities. Znf motifs occur in several unrelated protein superfamilies, varying in both sequence and structure. They display considerable versatility in binding modes, even between members of the same class (e. g., some bind DNA, others protein), suggesting that Znf motifs are stable scaffolds that have evolved specialised functions. For example, Znf containing proteins function in gene transcription, translation, mRNA trafficking, cytoskeleton organization, epithelial development, cell adhesion, protein folding, chromatin remodeling, and zinc sensing, to name but a few. Zinc binding motifs are stable structures, and they rarely undergo conformational changes upon binding their target.

Қолданбалар

Әртүрлі белок инженериясы әдістерін қолдану арқылы цинк саусақтарының ДНК-мен байланысу ерекшелігін өзгертуге болады, ал мұндай инженерлік цинк саусақтарының тандемдік қайталануларын қажетті геномдық ДНК тізбектерін анықтау үшін пайдалануға болады. Белгілі бір геннің промоторына жақын байланысатын инженерлік цинк саусақтарының жиынтығына транскрипциялық активатор немесе репрессор сияқты екінші белок доменін қосу арқылы сол геннің транскрипциясын өзгертуге болады.

Цинк саусақты нуклеазалар

Инженерлік цинк саусақтарының тізімдері көбінесе ДНК-ның кесу доменімен (әдетте FokI-дің кесу доменімен) біріктіріліп, цинк саусақтары нуклеазаларын құрайды. Мұндай цинк саусақтары-FokI қосылыстары Drosophila melanogaster, Caenorhabditis elegans, темекі, жүгері, әртүрлі сүтқоректі жасушалары және егеуқұйрықтар сияқты көптеген жоғары сатыдағы организмдердің геномдарын манипуляциялау үшін пайдалы реагенттерге айналды. Двойной спиральдық үзілісті қажетті геномдық орынға бағыттау, геномның кодтау тізбегіне қателікке бейім гомолог емес ДНК жөндеу механизміне байланысты фрейм сдвигі мутацияларын енгізу үшін қолданылуы мүмкін. Егер гомологты ДНК "донор тізбегі" де қолданылса, геномдық орын гомологиялық бағытталған жөндеу механизмі арқылы белгілі бір тізбекке айналдырылуы мүмкін. Қазіргі кезде жүргізіліп жатқан клиникалық сынақтардың бірі ХИВ/ЖИТС-ті емдеудің мүмкін болатын жолы ретінде CD4+ адамдық Т-жасушаларындағы CCR5 генін бұзатын цинк саусақтары нуклеазаларын бағалауда.

Цинк саусақ массивтерін жасау әдістері

Инженерлік цинк саусақ массивтерінің көпшілігі егесік транскрипция факторы Zif268-дің цинк саусақ доменіне негізделген, бірақ кейбір топтар адам транскрипция факторы SP1 негізінде цинк саусақ массивтерін қолданды. Zif268 жоғары туыстықпен 9 жұп тізбекті байланыстыратын үш жеке мырыш саусақ мотивтерін қамтиды. Бұл белоктың ДНК-ға байланысқан құрылымы 1991 жылы анықталды және инженерлік цинк саусақ массивтерін зерттеуге үлкен серпіліс берді. 1994 және 1995 жылдары бірнеше топ Zif268-дің бір мырыш саусағының ерекшелігін өзгерту үшін фаг дисплейін пайдаланды. Қазіргі уақытта инженерлік цинк саусақ массивтерін жасау үшін екі негізгі әдіс қолданылады: модульдік құрастыру және бактериялық іріктеу жүйесі. Қай әдіс көптеген қолданулар үшін жақсырақ екені туралы пікірталас бар. Жаңа цинк саусақ массивтерін жасаудың ең қарапайым жолы белгілі ерекшеліктері бар кішірек цинк саусақ "модульдерін" біріктіру болып табылады. Pavletich және Pabo-ның 1991 жылғы жарияланымдарында сипатталған ДНК-ға байланысқан Zif268 цинк саусақ ақуызының құрылымы осы жұмыстың көп бөлігі үшін маңызды болды және 64 мүмкін негіз жұбының әрқайсысы үшін саусақтарды алу және содан кейін осы саусақтарды араластырып, кез келген тізбектік ерекшеліктері бар ақуыздарды жобалау концепциясын сипаттайды. Scripps Research Institute-тың Barbas зертханасы фаг дисплейін пайдаланып, ДНК-ның көптеген үштік тізбектерін танитын цинк саусақ домендерін жасады және сипаттады, ал басқа топ адам геномнан жеке саусақтарды оқшаулады және сипаттады. Модульдік құрастырудың жалпы кемшілігі - жеке цинк саусақтың ерекшеліктері бір-бірімен қабаттасуы мүмкін және олар қоршаған цинк саусақтары мен ДНК контекстіне байланысты болуы мүмкін. Жақында жүргізілген зерттеуде модульдік құрастыру арқылы жасалған 3 саусақты цинк саусақ массивтерінің көп бөлігі бактериялық екі гибридтік талдау кезінде мақсатты нысанаға жеткілікті туыстықпен байланыса алмайтыны және цинк саусақ нуклеазалары ретінде жұмыс істей алмайтыны көрсетілді, бірақ GNNGNNGNN формасындағы сайттарды мақсат еткенде сәл жақсы нәтижелер байқалды. Кейінгі зерттеуде 3 саусақты және 4 саусақты массивтермен цинк саусақ нуклеазаларын жасау үшін модульдік құрастыру қолданылды және 4 саусақты массивтермен сәттілік деңгейі жоғары болды. Көршілес саусақтардың контекстін ескеретін модульдік құрастырудың бір түрі де хабарланды және бұл әдіс стандартты модульдік құрастыруға қарағанда жақсы нәтижелер беретін ақуыздарды алуға бейім. Қажетті тізбектерді нысанаға алатын цинк саусақ массивтерін жасау үшін көптеген іріктеу әдістері қолданылды. Бастапқы іріктеу жұмыстары фаг дисплейін пайдаланып, белгілі бір ДНК нысанасына байланысқан, ішінара кездейсоқ цинк саусақ массивтерінің үлкен жиынтығынан ақуыздарды іріктеді. Бұл әдісті бір мезгілде бірнеше цинк саусақтарында қолдану қиын болғандықтан, бір цинк саусақты қосып және оңтайландырып, толық оңтайландырылған 3 саусақты массив жасауға мүмкіндік беретін көп қадамдық процесс әзірленді. Соңғы жұмыстар ашытқының бір гибридтік, бактерияның бір гибридтік және екі гибридтік жүйелерін, сондай-ақ сүтқоректілер жасушаларын пайдаланды. 3 саусақты цинк саусақ массивтерін іріктеудің жаңа әдісі бактериялық екі гибридтік жүйені пайдаланады және оны жасаушылар "АШЫҚ" деп атады. Бұл жүйе алдын ала іріктелген жеке цинк саусақтарын біріктіреді, олардың әрқайсысы берілген үштікке байланысу үшін іріктелген, содан кейін 3 саусақты массивтерді алу үшін екінші іріктеу кезеңін пайдаланады, олар қажетті 9 жұп тізбекті байланыстыра алады. Бұл жүйе цинк саусақ консорциумымен коммерциялық инженерлік цинк саусақ массивтеріне балама ретінде әзірленді. Бұл әдіспен алынған ақуыздардың байланысу қасиеттерін модульдік құрастыру арқылы алынған ақуыздармен тікелей салыстыру қиын, өйткені АШЫҚ әдісімен алынған ақуыздардың ерекшелік профилі туралы ешқандай мәлімет жоқ.

The majority of engineered zinc finger arrays are based on the zinc finger domain of the murine transcription factor Zif268, although some groups have used zinc finger arrays based on the human transcription factor SP1. Zif268 has three individual zinc finger motifs that collectively bind a 9 bp sequence with high affinity. The structure of this protein bound to DNA was solved in 1991 and stimulated a great deal of research into engineered zinc finger arrays. In 1994 and 1995, a number of groups used phage display to alter the specificity of a single zinc finger of Zif268. There are two main methods currently used to generate engineered zinc finger arrays, modular assembly, and a bacterial selection system, and there is some debate about which method is best suited for most applications. The most straightforward method to generate new zinc finger arrays is to combine smaller zinc finger "modules" of known specificity. The structure of the zinc finger protein Zif268 bound to DNA described by Pavletich and Pabo in their 1991 publication has been key to much of this work and describes the concept of obtaining fingers for each of the 64 possible base pair triplets and then mixing and matching these fingers to design proteins with any desired sequence specificity. The Barbas Laboratory of The Scripps Research Institute used phage display to develop and characterize zinc finger domains that recognize most DNA triplet sequences while another group isolated and characterized individual fingers from the human genome. A potential drawback with modular assembly in general is that specificities of individual zinc finger can overlap and can depend on the context of the surrounding zinc fingers and DNA. A recent study demonstrated that a high proportion of 3 finger zinc finger arrays generated by modular assembly fail to bind their intended target with sufficient affinity in a bacterial two hybrid assay and fail to function as zinc finger nucleases, but the success rate was somewhat higher when sites of the form GNNGNNGNN were targeted. A subsequent study used modular assembly to generate zinc finger nucleases with both 3 finger arrays and 4 finger arrays and observed a much higher success rate with 4 finger arrays. A variant of modular assembly that takes the context of neighboring fingers into account has also been reported and this method tends to yield proteins with improved performance relative to standard modular assembly. Numerous selection methods have been used to generate zinc finger arrays capable of targeting desired sequences. Initial selection efforts utilized phage display to select proteins that bound a given DNA target from a large pool of partially randomized zinc finger arrays. This technique is difficult to use on more than a single zinc finger at a time, so a multi step process that generated a completely optimized 3 finger array by adding and optimizing a single zinc finger at a time was developed. More recent efforts have utilized yeast one hybrid systems, bacterial one hybrid and two hybrid systems, and mammalian cells. A promising new method to select novel 3 finger zinc finger arrays utilizes a bacterial two hybrid system and has been dubbed "OPEN" by its creators. This system combines pre selected pools of individual zinc fingers that were each selected to bind a given triplet and then utilizes a second round of selection to obtain 3 finger arrays capable of binding a desired 9 bp sequence. This system was developed by the Zinc Finger Consortium as an alternative to commercial sources of engineered zinc finger arrays. It is somewhat difficult to directly compare the binding properties of proteins generated with this method to proteins generated by modular assembly as the specificity profiles of proteins generated by the OPEN method have never been reported.