Цинковые пальцы: структура, функции и применение.

Введение

Малый структурный протеиновый мотив, встречающийся в основном в транскрипционных белках.

Цинковый палец – это небольшой протеиновый структурный мотив, характеризующийся координацией одного или нескольких ионов цинка (Zn2+), стабилизирующей его структуру. Изначально этот термин был введен для описания внешнего вида, напоминающего палец, гипотетической структуры транскрипционного фактора IIIA африканской когтевой лягушки (Xenopus laevis). Однако впоследствии было установлено, что он охватывает широкий спектр различных белковых структур в эукариотических клетках. В 1983 году впервые было показано, что Xenopus laevis TFIIIA содержит цинк и нуждается в этом металле для функционирования, что стало первым зарегистрированным случаем требования цинка для белка, регулирующего ген, и вскоре за ним последовал фактор Крюппеля в Drosophila. Он часто встречается в виде домена, связывающего металл, в многодоменных белках. Секвенирование аминокислот TFIIIA выявило девять тандемных последовательностей, состоящих из 30 аминокислот, включая две инвариантные пары цистеина и гистидина. Расширенная рентгеноструктурная спектроскопия подтвердила, что лигандами цинка являются два цистеина и два гистидина. Считалось, что петля, связывающая ДНК, формируемая координацией этих лигандов с цинком, напоминает пальцы, отсюда и название. Кристаллические структуры комплексов ДНК с цинковыми пальцами, определенные в 1991 и 1993 годах, показали каноническую схему взаимодействия цинковых пальцев с ДНК. Связывание цинковых пальцев отличается от многих других белков, связывающих ДНК посредством двухкратной симметрии двойной спирали; вместо этого цинковые пальцы связаны линейно в тандеме для связывания последовательностей нуклеиновых кислот различной длины. Модульная природа мотива цинкового пальца позволяет связывать большое количество комбинаций последовательностей ДНК и РНК с высокой степенью аффинности и специфичности, что делает его идеально подходящим для создания белков, которые могут быть нацелены на и связываться с определенными последовательностями ДНК. В 1994 году было показано, что искусственно сконструированный трехпальцевый белок может блокировать экспрессию онкогена в клеточной линии мыши. С тех пор были созданы цинковые пальцы, слитые с различными другими эффекторными доменами, некоторые из которых имеют терапевтическое значение. Их связывающие свойства зависят от аминокислотной последовательности доменов пальцев, линкера между пальцами, а также от структур высшего порядка и количества пальцев. Домены Znf часто встречаются в кластерах, где пальцы могут обладать различными специфическими свойствами связывания. Мотивы Znf встречаются в нескольких неродственных суперсемействах белков, различающихся как по последовательности, так и по структуре. Они демонстрируют значительную универсальность в способах связывания, даже между членами одного класса (например, некоторые связывают ДНК, другие – белки), что позволяет предположить, что мотивы Znf являются стабильными каркасами, которые эволюционировали для выполнения специализированных функций. Например, белки, содержащие Znf, участвуют в транскрипции генов, трансляции, транспорте мРНК, организации цитоскелета, развитии эпителия, клеточной адгезии, сворачивании белков, ремоделировании хроматина и сенсорной функции цинка, и это лишь некоторые из них. Мотивы связывания цинка являются стабильными структурами и редко претерпевают конформационные изменения при связывании с мишенью.

A zinc finger is a small protein structural motif that is characterized by the coordination of one or more zinc ions (Zn2+) which stabilizes the fold. It was originally coined to describe the finger like appearance of a hypothesized structure from the African clawed frog (Xenopus laevis) transcription factor IIIA. However, it has been found to encompass a wide variety of differing protein structures in eukaryotic cells. Xenopus laevis TFIIIA was originally demonstrated to contain zinc and require the metal for function in 1983, the first such reported zinc requirement for a gene regulatory protein followed soon thereafter by the Krüppel factor in Drosophila. It often appears as a metal binding domain in multi domain proteins. Amino acid sequencing of TFIIIA revealed nine tandem sequences of 30 amino acids, including two invariant pairs of cysteine and histidine residues. Extended x ray absorption fine structure confirmed the identity of the zinc ligands: two cysteines and two histidines. The DNA binding loop formed by the coordination of these ligands by zinc were thought to resemble fingers, hence the name. The crystal structures of zinc finger DNA complexes solved in 1991 and 1993 revealed the canonical pattern of interactions of zinc fingers with DNA. The binding of zinc finger is found to be distinct from many other DNA binding proteins that bind DNA through the 2 fold symmetry of the double helix, instead zinc fingers are linked linearly in tandem to bind nucleic acid sequences of varying lengths. The modular nature of the zinc finger motif allows for a large number of combinations of DNA and RNA sequences to be bound with high degree of affinity and specificity, and is therefore ideally suited for engineering protein that can be targeted to and bind specific DNA sequences. In 1994, it was shown that an artificially constructed three finger protein can block the expression of an oncogene in a mouse cell line. Zinc fingers fused to various other effector domains, some with therapeutic significance, have since been constructed. Their binding properties depend on the amino acid sequence of the finger domains and on the linker between fingers, as well as on the higher order structures and the number of fingers. Znf domains are often found in clusters, where fingers can have different binding specificities. Znf motifs occur in several unrelated protein superfamilies, varying in both sequence and structure. They display considerable versatility in binding modes, even between members of the same class (e. g., some bind DNA, others protein), suggesting that Znf motifs are stable scaffolds that have evolved specialised functions. For example, Znf containing proteins function in gene transcription, translation, mRNA trafficking, cytoskeleton organization, epithelial development, cell adhesion, protein folding, chromatin remodeling, and zinc sensing, to name but a few. Zinc binding motifs are stable structures, and they rarely undergo conformational changes upon binding their target.

Приложения

Различные методы белковой инженерии могут быть использованы для изменения специфичности связывания ДНК цинковых пальцев, а тандемные повторы таких сконструированных цинковых пальцев могут быть использованы для нацеливания на нужные последовательности геномной ДНК. Объединение второго белкового домена, например, транскрипционного активатора или репрессора, с массивом сконструированных цинковых пальцев, связывающихся вблизи промотора определенного гена, позволяет изменять транскрипцию этого гена.

Нуклеазы цинковых пальцев

Инженерные массивы цинковых пальцев часто объединяют с доменом расщепления ДНК (обычно доменом расщепления FokI) для создания нуклеаз цинковых пальцев. Такие соединения цинковых пальцев с FokI стали полезными реагентами для манипулирования геномами многих высокоорганизованных организмов, включая Drosophila melanogaster, Caenorhabditis elegans, табак, кукурузу, различные типы клеток млекопитающих и крыс. Нацеливание двунитевого разрыва на желаемый геномный локус можно использовать для введения сдвигающих рамку мутаций в кодирующую последовательность гена, благодаря подверженности ошибкам негомологичного пути репарации ДНК. При использовании гомологичной ДНК-"матричной" последовательности геномный локус может быть преобразован в заданную последовательность посредством репарации, направляемой гомологией. В настоящее время проводится клиническое испытание, оценивающее нуклеазы цинковых пальцев, нарушающие ген CCR5 в CD4+ Т-клетках человека, в качестве потенциального метода лечения ВИЧ/СПИДа.

Методы проектирования массивов цинковых пальцев

Большинство сконструированных массивов цинковых пальцев основаны на домене цинковых пальцев мышиного транскрипционного фактора Zif268, хотя некоторые группы использовали массивы цинковых пальцев, основанные на человеческом транскрипционном факторе SP1. Zif268 содержит три отдельных мотива цинковых пальцев, которые коллективно связывают последовательность в 9 пар оснований с высокой аффинностью. Структура этого белка, связанного с ДНК, была определена в 1991 году и стимулировала значительное количество исследований в области разработки массивов цинковых пальцев. В 1994 и 1995 годах несколько групп использовали фаговый дисплей для изменения специфичности отдельного цинкового пальца Zif268. В настоящее время используются два основных метода для создания сконструированных массивов цинковых пальцев: модульная сборка и система бактериального отбора, и существуют споры относительно того, какой метод лучше всего подходит для большинства задач. Наиболее простой способ создания новых массивов цинковых пальцев – комбинировать небольшие "модули" цинковых пальцев с известной специфичностью. Структура белка цинкового пальца Zif268, связанного с ДНК, описанная Павлетичем и Пабо в их публикации 1991 года, сыграла ключевую роль в большей части этой работы и описывает концепцию получения пальцев для каждого из 64 возможных триплетов оснований, а затем комбинирования этих пальцев для создания белков с любой желаемой специфичностью последовательности. Лаборатория Барбаса Института исследований Скриппса использовала фаговый дисплей для разработки и характеристики доменов цинковых пальцев, распознающих большинство последовательностей триплетов ДНК, в то время как другая группа изолировала и охарактеризовала отдельные пальцы из генома человека. Потенциальным недостатком модульной сборки в целом является то, что специфичности отдельных цинковых пальцев могут перекрываться и зависеть от контекста окружающих цинковых пальцев и ДНК. Недавнее исследование показало, что значительная доля 3-пальцевых массивов цинковых пальцев, сгенерированных с помощью модульной сборки, не связывается со своей целевой последовательностью с достаточной аффинностью в бактериальном двухгибридном анализе и не функционирует как цинковые пальцевые нуклеазы, однако частота успеха была несколько выше при нацеливании на участки формы GNNGNNGNN. Последующее исследование использовало модульную сборку для создания цинковых пальцевых нуклеаз как с 3-пальцевыми, так и с 4-пальцевыми массивами и показало значительно более высокую частоту успеха с 4-пальцевыми массивами. Также сообщалось о варианте модульной сборки, который учитывает контекст соседних пальцев, и этот метод, как правило, дает белки с улучшенными характеристиками по сравнению со стандартной модульной сборкой. Для создания массивов цинковых пальцев, способных нацеливаться на желаемые последовательности, использовались многочисленные методы отбора. Первоначальные усилия по отбору использовали фаговый дисплей для выбора белков, связывающих заданную ДНК-мишень из большого пула частично рандомизированных массивов цинковых пальцев. Этот метод сложно использовать на более чем одном цинковом пальце одновременно, поэтому был разработан многоступенчатый процесс, который генерировал полностью оптимизированный 3-пальцевый массив путем последовательного добавления и оптимизации отдельных цинковых пальцев. Более поздние исследования использовали системы "дрожжевой один-гибрид", "бактериальный один-гибрид" и "два-гибрид", а также клетки млекопитающих. Новый перспективный метод отбора 3-пальцевых массивов цинковых пальцев использует бактериальную двухгибридную систему и был назван его создателями "OPEN". Эта система объединяет предварительно отобранные пулы отдельных цинковых пальцев, каждый из которых был отобран для связывания заданного триплета, а затем использует второй раунд отбора для получения 3-пальцевых массивов, способных связывать желаемую последовательность в 9 пар оснований. Эта система была разработана Консорциумом цинковых пальцев в качестве альтернативы коммерческим источникам сконструированных массивов цинковых пальцев. Сравнивать свойства связывания белков, полученных этим методом, с белками, полученными с помощью модульной сборки, несколько сложно, поскольку профили специфичности белков, полученных методом OPEN, никогда не были опубликованы.

The majority of engineered zinc finger arrays are based on the zinc finger domain of the murine transcription factor Zif268, although some groups have used zinc finger arrays based on the human transcription factor SP1. Zif268 has three individual zinc finger motifs that collectively bind a 9 bp sequence with high affinity. The structure of this protein bound to DNA was solved in 1991 and stimulated a great deal of research into engineered zinc finger arrays. In 1994 and 1995, a number of groups used phage display to alter the specificity of a single zinc finger of Zif268. There are two main methods currently used to generate engineered zinc finger arrays, modular assembly, and a bacterial selection system, and there is some debate about which method is best suited for most applications. The most straightforward method to generate new zinc finger arrays is to combine smaller zinc finger "modules" of known specificity. The structure of the zinc finger protein Zif268 bound to DNA described by Pavletich and Pabo in their 1991 publication has been key to much of this work and describes the concept of obtaining fingers for each of the 64 possible base pair triplets and then mixing and matching these fingers to design proteins with any desired sequence specificity. The Barbas Laboratory of The Scripps Research Institute used phage display to develop and characterize zinc finger domains that recognize most DNA triplet sequences while another group isolated and characterized individual fingers from the human genome. A potential drawback with modular assembly in general is that specificities of individual zinc finger can overlap and can depend on the context of the surrounding zinc fingers and DNA. A recent study demonstrated that a high proportion of 3 finger zinc finger arrays generated by modular assembly fail to bind their intended target with sufficient affinity in a bacterial two hybrid assay and fail to function as zinc finger nucleases, but the success rate was somewhat higher when sites of the form GNNGNNGNN were targeted. A subsequent study used modular assembly to generate zinc finger nucleases with both 3 finger arrays and 4 finger arrays and observed a much higher success rate with 4 finger arrays. A variant of modular assembly that takes the context of neighboring fingers into account has also been reported and this method tends to yield proteins with improved performance relative to standard modular assembly. Numerous selection methods have been used to generate zinc finger arrays capable of targeting desired sequences. Initial selection efforts utilized phage display to select proteins that bound a given DNA target from a large pool of partially randomized zinc finger arrays. This technique is difficult to use on more than a single zinc finger at a time, so a multi step process that generated a completely optimized 3 finger array by adding and optimizing a single zinc finger at a time was developed. More recent efforts have utilized yeast one hybrid systems, bacterial one hybrid and two hybrid systems, and mammalian cells. A promising new method to select novel 3 finger zinc finger arrays utilizes a bacterial two hybrid system and has been dubbed "OPEN" by its creators. This system combines pre selected pools of individual zinc fingers that were each selected to bind a given triplet and then utilizes a second round of selection to obtain 3 finger arrays capable of binding a desired 9 bp sequence. This system was developed by the Zinc Finger Consortium as an alternative to commercial sources of engineered zinc finger arrays. It is somewhat difficult to directly compare the binding properties of proteins generated with this method to proteins generated by modular assembly as the specificity profiles of proteins generated by the OPEN method have never been reported.