Мұздан қорғау пептидтері: судың қатуын тежеу механизмі

Кіріспе

Мұзданудан аман қалуға көмектесетін пептидтер класы. Мұзда қарсы ақуыздар (МҚА) немесе мұзды құрылымдайтын ақуыздар – белгілі бір жануарлар, өсімдіктер, саңырауқұлақтар және бактериялар өндіретін полипептидтер класына жатады, олар судың қату температурасынан төмен температурада тіршілік етуге мүмкіндік береді. МҚА кішкентай мұз кристалдарына байланысып, мұздың өсуін және қайта кристалдануын тежейді, бұл әйтпесе өлімге әкелуі мүмкін. Сондай-ақ, МҚА сүтқоректілердің жасушалық мембраналарымен өзара әрекеттесіп, оларды суықтан зақымданудан қорғайтынына қатысты дәлелдер артып келеді. Бұл зерттеу МҚА-ның суыққа бейімделуге қатысы бар екенін көрсетеді.

Коллигациялық емес қасиеттер

Көлік құралдарында кеңінен қолданылатын этиленгликольден өзгеше, АФФ концентрация артуына пропорционалды түрде қату температурасын төмендетпейді. Керісінше, олар коллоидты емес қағида бойынша жұмыс істейді. Бұл құбылыс оларға басқа еріген заттарға қарағанда 1/300-ден 1/500-ге дейінгі концентрацияда антифриз ретінде әрекет етуге мүмкіндік береді. Олардың төмен концентрациясы осмостық қысымға тигізетін әсерін азайтады.

Термиялық гистереза

АФП балқу нүктесі мен қату нүктесі арасындағы айырмашылықты (АФП байланысқан мұз кристалдарының бұзылу температурасы) термиялық гистерезис деп атайды. Қатты мұз бен сұйық судың арасындағы интерфейсте АФП-лардың қосылуы мұз кристалдарының термодинамикалық тұрғыдан қолайлы өсуін тежейді. Мұздың өсуі мұздың суға қолжетімді бетін жабатын АФП-лармен кинетикалық түрде тежеледі. Олар мұз ядросын құрайтын ақуыздармен (INP) бірлесіп жұмыс істеп, мұзданудан кейінгі мұз таралу жылдамдығын басқарады. АФГП-лар нототениоидтар мен солтүстік балықтарында бөлек дамыған. Ноттеноидтарда АФГП гені ататектерінен қалған трипсиногенге ұқсас серин протеаза генінен пайда болған. I типтегі АФП қысқы балықта, ұзын мүйізді және қысқа мүйізді балықтарда кездеседі. Бұл ең жақсы зерттелген АФП, өйткені оның үш өлшемді құрылымы алғаш рет анықталды. I типтегі АФП бір, ұзын, амфипатиялық альфа-спиральдан тұрады, шамамен 3,3–4,5 кД. 3D құрылымының үш жағы бар: гидрофобтық, гидрофильді және Thr Asx жағы. Бұл қабілет оның I типті мұз байланысу орнының көптеген қайталануынан туындайды. II типтегі АФП-лар (мысалы) теңіз құйрығында, көк шелпекте және сельдьде кездеседі. Олар цистеинге бай, бес дисульфидтік байланысы бар шар тәрізді ақуыздар. II типтегі АФП-лар кальцийге тәуелді (c типті) лектиндерден пайда болған. Теңіз құйрығы, көк шелпек және сельдь – телеосттардың бір-бірінен мүлдем өзгеше туыс топтары. Егер АФП гені осы топтардың ең соңғы ортақ ата-тегінде болған болса, геннің осы топтарда шашыраңқы орналасқаны, кейбір қатарларда бар, ал басқаларында жоқ болуы қызық. Бұл айырмашылықтың себебі жақтық геннің көшірілуі болуы мүмкін, яғни көк шелпек II типтегі АФП генін сельдьтен алған. III типтегі АФП Антарктидалық балықта кездеседі. Олар I типтегі АФП-мен салыстырылатын мұз байланысу беттеріндегі жалпы гидрофобтылықты көрсетеді. Олардың мөлшері шамамен 6 кД. IV типтегі АФП ұзын мүйізді балықтарда кездеседі. Олар глютамат пен глутаминге бай альфа-спиральді ақуыздар. Бұл ақуыз шамамен 12 кДа және 4 спиральді түйінден тұрады. Өсімдік АФП-лары басқа АФП-лардан келесі аспектілер бойынша ерекшеленеді:

AFPs create a difference between the melting point and freezing point (busting temperature of AFP bound ice crystal) known as thermal hysteresis. The addition of AFPs at the interface between solid ice and liquid water inhibits the thermodynamically favored growth of the ice crystal. Ice growth is kinetically inhibited by the AFPs covering the water accessible surfaces of ice. They may work in conjunction with ice nucleating proteins (INPs) to control the rate of ice propagation following freezing. AFGPs evolved separately in notothenioids and northern cod. In notothenioids, the AFGP gene arose from an ancestral trypsinogen like serine protease gene. Type I AFP is found in winter flounder, longhorn sculpin and shorthorn sculpin. It is the best documented AFP because it was the first to have its three dimensional structure determined. Type I AFP consists of a single, long, amphipathic alpha helix, about 3.3 4.5 kD in size. There are three faces to the 3D structure: the hydrophobic, hydrophilic, and Thr Asx face. The ability is partially derived from its many repeats of the Type I ice binding site. Type II AFPs (e. g. ) are found in sea raven, smelt and herring. They are cysteine rich globular proteins containing five disulfide bonds. Type II AFPs likely evolved from calcium dependent (c type) lectins. Sea ravens, smelt, and herring are quite divergent lineages of teleost. If the AFP gene were present in the most recent common ancestor of these lineages, it is peculiar that the gene is scattered throughout those lineages, present in some orders and absent in others. It has been suggested that lateral gene transfer could be attributed to this discrepancy, such that the smelt acquired the type II AFP gene from the herring. Type III AFPs are found in Antarctic eelpout. They exhibit similar overall hydrophobicity at ice binding surfaces to type I AFPs. They are approximately 6kD in size. Type IV AFPs are found in longhorn sculpins. They are alpha helical proteins rich in glutamate and glutamine. This protein is approximately 12KDa in size and consists of a 4 helix bundle. Plant AFPs are rather different from the other AFPs in the following aspects:

Олардың термиялық гистерезистік белсенділігі басқа АФП-лармен салыстырғанда әлдеқайда төмен. Олардың физиологиялық функциясы мұздың пайда болуын болдырмау емес, қайта кристалдануын тежеу болып табылады. Басқа қоңыздар (Rhagium туысы) ішкі дисульфидтік байланыстарсыз ұзақ қайталануларға ие, олар төрт қатарлы треонин қалдықтары бар қысылған бета-соленоидты (бета-сэндвич) құрайды, ал бұл АФП-ның құрылымы бледное красота мотылынан алынған гомолог емес АФП-ға ұқсас. Ал шырша құрттысы көбелегінің АФП-сы Tenebrio ақуызына ұқсас, мұзбен байланысатын беті бар, бірақ үшбұрышты қимасы бар, ішкі дисульфидтік байланыстар жоқ, ұзақ қайталанулары бар соленоид. АФП-ның құрылымы тенбрио мен дендроидтардағыға ұқсас, бірақ дисульфидтік бета-соленоид 10 аминокислотаның қысқа қайталануынан түзіледі, ал треониннің орнына мұз байланыстыру беті тирозин қалдықтарының бір қатарынан тұрады. Спрингтейлдер (Collembola) жәндіктер емес, бірақ жәндіктер сияқты, олар алты аяқты буынтұқымдылар. Канадада кездесетін бір түрді "қар құйрығы" деп атайды. Ал басқа жәндіктер, мысалы Алясканың қоңызы, тіпті аз ұқсас гиперактивті антифриздерді шығарады, өйткені олар амин қышқылдарының (ақуыздардың) полимерлері емес, қант полимерлері (ксиломаннан) болып табылады. Бұл мәліметтерді ескерсек, көптеген АФП-лар мен антифриздер осы түрлі жәндіктерді тудырған топтар бөлініп кеткеннен кейін пайда болған деген қорытындыға келуге болады. Олардың ортақ ұқсастықтары конвергентті эволюцияның нәтижесі.

Теңіз мұзының АФП-ы

Теңіз мұздарында тіршілік ететін көптеген микроорганизмдерде бір тұқымдасқа жататын АФФ-тар бар. Диатомдар Fragilariopsis cylindrus және F. curta полярлық теңіз мұздықтарының қауымдастықтарында маңызды рөл атқарады, тромбоциттер қабаты мен қаптама мұздарында басымдық құрайды. AFP-тер осы түрлерде кең таралған, ал AFP гендерінің көпгендік отбасы ретінде кездесуі Fragilariopsis туысы үшін осы топтың маңыздылығын көрсетеді. F. cylindrus-та анықталған AFP-лер әртүрлі таксондарда кездесетін AFP отбасына жатады және теңіз мұзымен байланысты басқа организмдерде (Colwellia spp., Navicula glaciei, Chaetoceros neogracile, Stephos longipes, Leucosporidium antarcticum), Антарктиканың ішкі мұз бактерияларында (Flavobacteriaceae), сондай-ақ суыққа төзімді саңырауқұлақтарда (Typhula ishikariensis, Lentinula edodes, Flammulina populicola) табылған. Теңіз мұзының AFP-терінің бірнеше құрылымдары анықталды. Бұл ақуыздар бета-спиральға жиырылып, жалпақ мұзға байланысатын бет жасайды. Басқа AFP-лерден айырмашылығы, мұзға байланысатын орын үшін бірегей тізбек мотиві жоқ. Euplotes focardii цилиясы мен психофильді бактериялардың метагеномынан табылған AFP мұздың қайта кристалдануын тиімді тежейді. 1 мкМ Euplotes focardii консорциумының мұзға байланысатын ақуызы (EfcIBP) –7.4°C температурада мұздың қайта кристалдануын толығымен тежеуге жеткілікті. Мұздың қайта кристалдануын тежейтін бұл қабілет бактерияларға мұздың пайда болуын болдырмай, оны төзуге көмектеседі. EfcIBP жылу гистерезисін де тудырады, бірақ бұл қабілет мұздың қайта кристалдануын тежеуге қарағанда тиімді емес. EfcIBP тазаланған ақуыздарды да, бүтін бактериялық жасушаларды да тоңазытқыш температурада қорғауға көмектеседі. EfcIBP-мен инкубацияланған кезде жасыл флуоресцентті ақуыз бірнеше рет мұздату мен еруден кейін де функционалды болып қалады. E. coli-ге efcIBP генін енгізген кезде ол 0°C температурада ұзақ уақыт тірі қалады. Антарктиканың салқындауы осы кезеңде мұздық температураға төтеп бере алмаған телост түрлерінің жаппай қырылуына себеп болды. Антифриз гликопротеині бар нототениоидтар мұздық оқиғадан аман қалды және жаңа экологиялық нишаларға бейімделді. Екі балық отрядында ұқсас антифриз ақуыздары болғанымен, балықтарда аргинин бар, ал Антарктикалық нототениоидтарда аргинин жоқ. Бұрынғы зерттеулер осы қарақұмықтың антифриз ақуызын күшейтетін түрлі факторларды тапты, олардың ішінде тауматин тәрізді ақуыз бен поликарбоксилаттар бар. DAFP 1-ді аргининге тән реагентпен модификациялау DAFP 1-де жылу гистерезисінің ішінара және толық жоғалуына әкелді, бұл аргинин оның қабілетін арттыруда маңызды рөл атқаратынын көрсетеді. DAFP 4-тің ТГ белсенділігі pH-қа тәуелді болған жоқ, бірақ төмен ерітілген зат концентрациясы (pH 1) болғанда ТГ төмендеді. Геннің көшірмелерінің саны герингте гельге қарағанда 8 есе көп болғандықтан, герингтен гельге гендердің көшірілуі белгілі (1), ал гельдегі ген сегменттері герингке тән және жиі кездесетін, бірақ басқа балықтарда кездеспейтін транслокациялық элементтерді қамтиды. Антифриз гликопротеин белсенділігі бірнеше шаян жамбас түрлерінде, соның ішінде балықтар, скульпиндер және трескалар арасында байқалды. Антифриз гликопротеинін иеленетін балық түрлері әр түрлі деңгейдегі ақуыз белсенділігін көрсетеді. Полярлық треска (Boreogadus saida) Антарктикалық түрлерге ұқсас ақуыздық белсенділігі мен қасиеттерін көрсетеді, T. borchgrevinki. Көлденең гендік трансфер F. cylindrus және F. curta екі теңіз диатомиясының мұзға қарсы ақуыздарының болуына жауапты. Олар мұздың базалық емес жазықтықтарына адсорбцияланып, термодинамикалық тұрғыдан қолайлы мұздың өсуін тежейді. Кейбір AFP-лердегі жалпақ, қатты бет мұзбен Ван дер Ваальс күші арқылы беттік үйлесімділік арқылы өзара әрекеттесуін жеңілдетеді.

Many microorganisms living in sea ice possess AFPs that belong to a single family. The diatoms Fragilariopsis cylindrus and F. curta play a key role in polar sea ice communities, dominating the assemblages of both platelet layer and within pack ice. AFPs are widespread in these species, and the presence of AFP genes as a multigene family indicates the importance of this group for the genus Fragilariopsis. AFPs identified in F. cylindrus belong to an AFP family which is represented in different taxa and can be found in other organisms related to sea ice (Colwellia spp., Navicula glaciei, Chaetoceros neogracile and Stephos longipes and Leucosporidium antarcticum) and Antarctic inland ice bacteria (Flavobacteriaceae), as well as in cold tolerant fungi (Typhula ishikariensis, Lentinula edodes and Flammulina populicola). Several structures for sea ice AFPs have been solved. This family of proteins fold into a beta helix that form a flat ice binding surface. Unlike the other AFPs, there is not a singular sequence motif for the ice binding site. AFP found from the metagenome of the ciliate Euplotes focardii and psychrophilic bacteria has an efficient ice re crystallization inhibition ability. 1 μM of Euplotes focardii consortium ice binding protein (EfcIBP) is enough for the total inhibition of ice re crystallization in –7.4 °C temperature. This ice recrystallization inhibition ability helps bacteria to tolerate ice rather than preventing the formation of ice. EfcIBP produces also thermal hysteresis gap, but this ability is not as efficient as the ice recrystallization inhibition ability. EfcIBP helps to protect both purified proteins and whole bacterial cells in freezing temperatures. Green fluorescent protein is functional after several cycles of freezing and melting when incubated with EfcIBP. Escherichia coli survives longer periods in 0 °C temperature when the efcIBP gene was inserted to E. coli genome. The cooling of Antarctic imposed from this current caused a mass extinction of teleost species that were unable to withstand freezing temperatures. Notothenioids species with the antifreeze gylcoprotein were able to survive the glaciation event and diversify into new niches. Although the two fish orders have similar antifreeze proteins, cod species contain arginine in AFG, while Antarctic notothenioid do not. Previous research has found various enhancers of this bettles' antifreeze protein including a thaumatin like protein and polycarboxylates. Modifications of DAFP 1 with the arginine specific reagent resulted in the partial and complete loss of thermal hysteresis in DAFP 1, indicating that arginine plays a crucial role in enhancing its ability. TH activity of DAFP 4 was not affected by pH unless the there was a low solute concentration (pH 1) in which TH decreased. The direction of transfer is known to be from herring to smelt as herring have 8 times the copies of AFP gene as smelt (1) and the segments of the gene in smelt house transposable elements which are otherwise characteristic of and common in herring but not found in other fishes. Antifreeze glycoprotein activity has been observed across several ray finned species including eelpouts, sculpins, and cod species. Fish species that possess the antifreeze glycoprotein express different levels of protein activity. Polar cod (Boreogadus saida) exhibit similar protein activity and properties to the Antarctic species, T. borchgrevinki. Horizontal gene transfer is responsible for the presence of ice antifreeze proteins in two sea diatom species, F. cylindrus and F. curta. They adsorb to nonbasal planes of ice, inhibiting thermodynamically favored ice growth. The presence of a flat, rigid surface in some AFPs seems to facilitate its interaction with ice via Van der Waals force surface complementarity.

Мұзға байлау

Әдетте, ерітіндіде өсірілген мұз кристалдары тек базальды (0001) және призмалық (1010) жақтарын көрсетеді және дөңгелек, жазық дискілер түрінде болады. I типті АФП-ні зерттеулер нәтижесінде бастапқыда мұз бен АФП сутекті байланыс арқылы өзара әрекеттеседі деп есептелді (Raymond and DeVries, 1977). Бірақ, осы сутекті байланысты қамтамасыз ететін деп саналған ақуыздың бөліктері мутацияланғанда, антифриздік белсенділіктің күтілгендей төмендеуі байқалмады. Жақындағы мәліметтер гидрофобтық өзара әрекеттесулердің басты себепші болуы мүмкін екенін көрсетеді. Мұз бен судің күрделі интерфейсі болғандықтан, байланыс механизмін анықтау қиын. Қазіргі уақытта молекулалық модельдеу бағдарламаларын (молекулалық динамика немесе Монте-Карло әдісі) қолдану арқылы нақты механизмді анықтауға талпыныс жасалып жатыр. I типті АФП молекуласының антифриздік механизмі, оның төрт Thr қалдығының гидроксилдік топтарының мұз ядролық құрылымымен, қышқылдағы бағыт бойынша мұз торларындағы мұз пирамидалық жазықтықтарының өсуін тоқтатып немесе баяулатып, осылайша қату температурасын төмендету арқылы байланысуынан туындайды. Бұл ақуыздар кейіннен антифриз гликопротеиндері (AFGP) немесе антифриз гликопептидтері деп аталды, оларды жаңадан ашылған, гликопротеин емес биологиялық антифриз агенттерінен (AFP) ажырату үшін. DeVries Роберт Feeney (1970) есімді ғалыммен бірлесіп антифриз ақуыздарының химиялық және физикалық қасиеттерін зерттеді. 1992 жылы Griffith et al. қысқы қара бидай жапырақтарында АФП-ні тапқандарын хабарлады. Келесі жылы Duman және Olsen AFP-нің 23-тен астам гүлді өсімдік түрлерінде, соның ішінде адамдар жейтін түрлерінде де табылғанын атап өтті. Олар олардың саңырауқұлақтар мен бактерияларда да кездесетінін көрсетті.

Атауын өзгерту

Соңғы кезде антифриз ақуыздарын олардың функциясын дәлірек көрсету үшін және антифриз ақуыздары (АФА) мен автомобиль антифризі, этилен гликолі арасындағы қате түсініктерді жою үшін мұз құрылымдаушы ақуыздар деп қайта атауға талпыныстар жасалып жатыр. Бұл екі нәрсе толығымен бөлек, олардың функцияларында ғана белгілі бір ұқсастық бар.

Соңғы жаңалықтар

Соңғы кездегі сәтті бизнес-жоба – антифриздік белоктарды (АФБ) балмұздақ және йогурт өнімдеріне енгізу. Бұл ингредиент, «мұз құрылымдық белок» деп таңбаланған, Азық-түлік және дәрі-дәрмек басқармасымен мақұлданған. Белоктар балықтан бөлініп алынып, генетикалық түрлендірілген ашытқыда кең көлемде көбейтіледі. Генетикалық түрлендірілген организмдерге (ГМО) қарсы шығатын ұйымдар антифриздік белоктар қабынуға себеп болуы мүмкін деп алаңдайды. Солтүстік және орташа белдеулерде АФБ-ні тамақпен қабылдау көлемі қазірдің өзінде жоғары болуы мүмкін. Олар жүк тиеу платформасында немесе ас үйде еріген кезде пайда болатын мұз кристалдарының өсуін бақылап, текстураның сапасын төмендетеді. 2009 жылдың қараша айында Ұлттық ғылым академиясының басылымдарында Аляска қоңызынан табылған, АФБ сияқты қызмет ететін, бірақ сахаридтер мен май қышқылдарынан тұратын молекуланың жаңалықтары жарияланды. 2021 жылы EPFL және Уорвик ғалымдары антифриздік белоктардың жасанды имитациясын жасады.