Эндоспоры бактерий: структура выживания

Введение

Защитная структура, формируемая бактериями.

Эндоспора – это покоящаяся, прочная и нерепродуктивная структура, производимая некоторыми бактериями из типа Bacillota. Название "эндоспора" указывает на форму, напоминающую спору или семя (эндо означает "внутри"), но это не настоящая спора (то есть, не потомство). Это упрощенная, покоящаяся форма, в которую бактерия может перейти. Образование эндоспор обычно вызывается недостатком питательных веществ и, как правило, происходит у грамположительных бактерий. При образовании эндоспоры бактерия делится внутри своей клеточной стенки, и одна часть затем поглощает другую. Когда окружающая среда становится более благоприятной, эндоспора может вернуться в вегетативное состояние. Большинство видов бактерий не способны переходить в форму эндоспоры. Примеры бактериальных видов, способных образовывать эндоспоры, включают Bacillus cereus, Bacillus anthracis, Bacillus thuringiensis, Clostridium botulinum и Clostridium tetani. Образование эндоспор не встречается у архей. Эндоспора состоит из ДНК бактерии, рибосом и большого количества дипиколиновой кислоты. Дипиколиновая кислота – это химическое вещество, специфичное для спор, которое, по-видимому, способствует способности эндоспор поддерживать состояние покоя. Этот химикат составляет до 10% сухого веса споры. Распространенные антибактериальные препараты, которые действуют путем разрушения вегетативных клеточных стенок, не влияют на эндоспоры. Эндоспоры обычно встречаются в почве и воде, где они могут выживать в течение длительного времени. Различные микроорганизмы образуют "споры" или "цисты", но эндоспоры грамположительных бактерий с низким содержанием Г+Ц наиболее устойчивы к неблагоприятным условиям.

Местоположение

Положение эндоспоры различается у разных видов бактерий и полезно для их идентификации. Основными типами, встречающимися внутри клетки, являются терминальные, субтерминальные и центрально расположенные эндоспоры. Терминальные эндоспоры наблюдаются на полюсах клеток, в то время как центральные эндоспоры располагаются примерно в середине клетки. Субтерминальные эндоспоры находятся между этими двумя крайностями, обычно достаточно близко к полюсам, но не настолько, чтобы считаться терминальными, и достаточно близко к центру, чтобы не считаться центральными. Боковые эндоспоры встречаются изредка. Примером бактерий с терминальными эндоспорами является Clostridium tetani, патоген, вызывающий столбняк. К бактериям с центрально расположенной эндоспорой относится Bacillus cereus. Иногда эндоспора может быть настолько крупной, что клетка расширяется вокруг неё. Это характерно для Clostridium tetani.

Формирование и разрушение

В условиях голодания, особенно при недостатке источников углерода и азота, в некоторых бактериях формируется одна эндоспора посредством процесса, называемого споруляцией. Когда бактерия обнаруживает, что условия окружающей среды становятся неблагоприятными, она может запустить процесс эндоспоруляции, который занимает около восьми часов. ДНК реплицируется, и между ней и остальной частью клетки начинает формироваться мембранная стенка, известная как споровая перегородка. Плазматическая мембрана клетки окружает эту стенку и отпочковывается, образуя двойную мембрану вокруг ДНК, и развивающаяся структура теперь называется проспорой. В это время в проспору включается дипиколинат кальция, кальциевая соль дипиколиновой кислоты. Дипиколиновая кислота помогает стабилизировать белки и ДНК в эндоспоре. Далее формируется пептидогликановая кора между двумя слоями, и бактерия добавляет споровую оболочку снаружи проспоры. На заключительных стадиях формирования эндоспоры вновь образованная эндоспора обезвоживается и созревает, прежде чем высвободиться из материнской клетки. Более высокие концентрации отбеливателя не более эффективны и могут приводить к агрегации некоторых типов бактерий, что способствует их выживанию. Хотя эндоспоры значительно устойчивы к нагреванию и радиации, их можно уничтожить сжиганием или автоклавированием при температуре, превышающей 100 °C, температуру кипения воды. Эндоспоры способны выживать при 100 °C в течение нескольких часов, хотя чем больше продолжительность воздействия, тем меньше их выживает. Косвенный способ их уничтожения – поместить их в среду, которая активирует их в вегетативное состояние. При подходящих условиях окружающей среды они прорастают в течение одного-двух дней, после чего вегетативные клетки, менее устойчивые, чем эндоспоры, могут быть легко уничтожены. Этот косвенный метод называется тиндализацией. Он был распространенным в конце XIX века до появления недорогих автоклавов. Длительное воздействие ионизирующего излучения, такого как рентгеновские и гамма-лучи, также убивает большинство эндоспор. Эндоспоры определенных видов (обычно непатогенных) бактерий, таких как Geobacillus stearothermophilus, используются в качестве индикаторов для проверки истинной стерильности автоклавированного материала: небольшая капсула, содержащая споры, помещается в автоклав вместе с материалом; после цикла содержимое капсулы культивируется для проверки наличия роста. Если рост отсутствует, значит, споры были уничтожены и стерилизация прошла успешно. В больницах эндоспоры на деликатных инвазивных инструментах, таких как эндоскопы, уничтожаются стерилизаторами на основе этиленоксида при низкой температуре и без коррозионного воздействия. Этиленоксид – единственный стерилизатор низкой температуры, способный предотвратить вспышки инфекций, связанных с этими инструментами. В отличие от этого, "высокоуровневая дезинфекция" не убивает эндоспоры, но используется для инструментов, таких как колоноскоп, которые не проникают в стерильные полости тела. Этот метод использует только теплую воду, ферменты и моющие средства. Бактериальные эндоспоры устойчивы к антибиотикам, большинству дезинфицирующих средств и физическим факторам, таким как радиация, кипячение и высушивание. Считается, что непроницаемость споровой оболочки является причиной устойчивости эндоспоры к химическим веществам. Термостойкость эндоспор обусловлена рядом факторов: дипиколинат кальция, в изобилии содержащийся в эндоспоре, может стабилизировать и защитить ДНК эндоспоры. Небольшие кислото-растворимые белки (SASP) насыщают ДНК эндоспоры и защищают ее от нагревания, высушивания, химических веществ и радиации. Они также служат источником углерода и энергии для развития вегетативной бактерии во время прорастания. Кортекс может осмотически удалять воду изнутри эндоспоры, и считается, что возникающее обезвоживание играет важную роль в устойчивости эндоспоры к нагреванию и радиации. Наконец, ферменты репарации ДНК, содержащиеся в эндоспоре, способны восстанавливать поврежденную ДНК во время прорастания.

Under conditions of starvation, especially the lack of carbon and nitrogen sources, a single endospore forms within some of the bacteria through a process called sporulation. When a bacterium detects environmental conditions are becoming unfavourable it may start the process of endosporulation, which takes about eight hours. The DNA is replicated and a membrane wall known as a spore septum begins to form between it and the rest of the cell. The plasma membrane of the cell surrounds this wall and pinches off to leave a double membrane around the DNA, and the developing structure is now known as a forespore. Calcium dipicolinate, the calcium salt of dipicolinic acid, is incorporated into the forespore during this time. The dipicolinic acid helps stabilize the proteins and DNA in the endospore. Next the peptidoglycan cortex forms between the two layers and the bacterium adds a spore coat to the outside of the forespore. In the final stages of endospore formation the newly forming endospore is dehydrated and allowed to mature before being released from the mother cell. Higher concentrations of bleach are not more effective, and can cause some types of bacteria to aggregate and thus survive. While significantly resistant to heat and radiation, endospores can be destroyed by burning or by autoclaving at a temperature exceeding the boiling point of water, 100 °C. Endospores are able to survive at 100 °C for hours, although the larger the number of hours the fewer that will survive. An indirect way to destroy them is to place them in an environment that reactivates them to their vegetative state. They will germinate within a day or two with the right environmental conditions, and then the vegetative cells, not as hardy as endospores, can be straightforwardly destroyed. This indirect method is called Tyndallization. It was the usual method for a while in the late 19th century before the introduction of inexpensive autoclaves. Prolonged exposure to ionising radiation, such as x rays and gamma rays, will also kill most endospores. The endospores of certain types of (typically non pathogenic) bacteria, such as Geobacillus stearothermophilus, are used as probes to verify that an autoclaved item has been rendered truly sterile: a small capsule containing the spores is put into the autoclave with the items; after the cycle the content of the capsule is cultured to check if anything will grow from it. If nothing will grow, then the spores were destroyed and the sterilization was successful. In hospitals, endospores on delicate invasive instruments such as endoscopes are killed by low temperature, and non corrosive, ethylene oxide sterilizers. Ethylene oxide is the only low temperature sterilant to stop outbreaks on these instruments. In contrast, "high level disinfection" does not kill endospores but is used for instruments such as a colonoscope that do not enter sterile bodily cavities. This latter method uses only warm water, enzymes, and detergents. Bacterial endospores are resistant to antibiotics, most disinfectants, and physical agents such as radiation, boiling, and drying. The impermeability of the spore coat is thought to be responsible for the endospore's resistance to chemicals. The heat resistance of endospores is due to a variety of factors:
Calcium dipicolinate, abundant within the endospore, may stabilize and protect the endospore's DNA. Small acid soluble proteins (SASPs) saturate the endospore's DNA and protect it from heat, drying, chemicals, and radiation. They also function as a carbon and energy source for the development of a vegetative bacterium during germination. The cortex may osmotically remove water from the interior of the endospore and the dehydration that results is thought to be very important in the endospore's resistance to heat and radiation. Finally, DNA repair enzymes contained within the endospore are able to repair damaged DNA during germination.

Реактивация

Реактивация эндоспоры происходит при более благоприятных условиях и включает активацию, прорастание и рост. Даже если эндоспора находится в избытке питательных веществ, она может не прорасти, если активация не произошла. Активация может быть вызвана нагреванием эндоспоры. Прорастание включает в себя начало метаболической активности дремлющей эндоспорой, что приводит к выходу из состояния покоя. Обычно это характеризуется разрывом или поглощением споровой оболочки, набуханием эндоспоры, увеличением метаболической активности и потерей устойчивости к воздействию факторов окружающей среды. Рост следует за прорастанием и включает в себя синтез новых химических компонентов ядром эндоспоры и выход из старой споровой оболочки для развития в полноценную вегетативную бактериальную клетку, которая может делиться с образованием новых клеток. Эндоспоры содержат в пять раз больше серы, чем вегетативные клетки. Избыток серы концентрируется в споровых оболочках в виде аминокислоты цистеина. Считается, что макромолекула, ответственная за поддержание состояния покоя, имеет белковый слой, богатый цистином, стабилизированный S-S связями. Разрыв этих связей может изменить третичную структуру, вызывая денатурацию белка. Считается, что это конформационное изменение белка обеспечивает обнажение активных ферментативных центров, необходимых для прорастания эндоспоры. Эндоспоры могут оставаться в состоянии покоя в течение очень длительного времени. Например, эндоспоры были обнаружены в гробницах египетских фараонов. При помещении в подходящую среду и в соответствующих условиях они могли быть реактивированы. В 1995 году Рауль Кано из Калифорнийского политехнического государственного университета обнаружил бактериальные споры в кишечнике окаменелой пчелы, заключенной в янтарь из дерева в Доминиканской Республике. Возраст окаменелости пчелы в янтаре оценивается примерно в 25 миллионов лет. Споры проросли, когда янтарь был расколот, а материал из кишечника пчелы извлекли и поместили в питательную среду. После анализа спор под микроскопом было установлено, что клетки очень похожи на Lysinibacillus sphaericus, который сегодня встречается у пчел в Доминиканской Республике.

Reactivation of the endospore occurs when conditions are more favourable and involves activation, germination, and outgrowth. Even if an endospore is located in plentiful nutrients, it may fail to germinate unless activation has taken place. This may be triggered by heating the endospore. Germination involves the dormant endospore starting metabolic activity and thus breaking hibernation. It is commonly characterised by rupture or absorption of the spore coat, swelling of the endospore, an increase in metabolic activity, and loss of resistance to environmental stress. Outgrowth follows germination and involves the core of the endospore manufacturing new chemical components and exiting the old spore coat to develop into a fully functional vegetative bacterial cell, which can divide to produce more cells. Endospores possess five times more sulfur than vegetative cells. This excess sulfur is concentrated in spore coats as an amino acid, cysteine. It is believed that the macromolecule accountable for maintaining the dormant state has a protein coat rich in cystine, stabilized by S S linkages. A reduction in these linkages has the potential to change the tertiary structure, causing the protein to unfold. This conformational change in the protein is thought to be responsible for exposing active enzymatic sites necessary for endospore germination. Endospores can stay dormant for a very long time. For instance, endospores were found in the tombs of the Egyptian pharaohs. When placed in appropriate medium, under appropriate conditions, they were able to be reactivated. In 1995, Raul Cano of California Polytechnic State University found bacterial spores in the gut of a fossilized bee trapped in amber from a tree in the Dominican Republic. The bee fossilized in amber was dated to being about 25 million years old. The spores germinated when the amber was cracked open and the material from the gut of the bee was extracted and placed in nutrient medium. After the spores were analyzed by microscopy, it was determined that the cells were very similar to Lysinibacillus sphaericus which is found in bees in the Dominican Republic today.

Биотехнология

Споры Bacillus subtilis полезны для экспрессии рекомбинантных белков и, в особенности, для поверхностного экспонирования пептидов и белков как инструмента фундаментальных и прикладных исследований в области микробиологии, биотехнологии и вакцинологии.