Bacillus cereus: характеристика, свойства и значение

Введение

Вид бактерии

Bacillus cereus – это грамположительная палочковидная бактерия, обычно встречающаяся в почве, пищевых продуктах и морских губках. Видовое название cereus, что означает «восковой» на латыни, относится к внешнему виду колоний, выращенных на кровяном агаре. Некоторые штаммы опасны для человека и вызывают пищевые отравления благодаря своей способности к спорообразованию, в то время как другие штаммы могут быть полезны в качестве пробиотиков для животных и даже проявляют мутуализм с определенными растениями. Штаммы B. cereus демонстрируют жгутиковую подвижность. Группа Bacillus cereus включает семь тесно связанных видов: B. cereus sensu stricto (далее именуемый B. cereus), B. anthracis, B. thuringiensis, B. mycoides, B. pseudomycoides и B. cytotoxicus; либо как шесть видов в Bacillus cereus sensu lato: B. weihenstephanensis, B. mycoides, B. pseudomycoides, B. cereus, B. thuringiensis и B. anthracis. Филогеномный анализ, объединенный с анализом средней нуклеотидной идентичности (ANI), показал, что вид B. anthracis также включает штаммы, классифицированные как B. cereus и B. thuringiensis.

История

Колонии B. cereus были впервые выделены из желатиновой пластинки, оставленной на открытом воздухе в коровнике в 1887 году. В 2010-х годах анализ предупредительных писем, выпущенных Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и лекарств США (FDA) фармацевтическим производственным предприятиям в связи с микробным загрязнением помещений, показал, что наиболее частым загрязнителем являлся B. cereus. В B. cereus обнаружено несколько новых ферментов, таких как AlkC и AlkD, которые оба участвуют в репарации ДНК.

Микробиология

B. cereus – это палочковидная бактерия с грамположительной клеточной стенкой. В зависимости от штамма, она может быть анаэробной или факультативно анаэробной. Большинство штаммов мезофильны, с оптимальной температурой от 25 °C до 37 °C, и нейтралофильны, предпочитая нейтральный pH, но некоторые способны расти в средах с гораздо более экстремальными условиями. Эти бактерии способны к образованию спор и биопленок, что представляет серьезную проблему для пищевой промышленности из-за их контаминирующих свойств. Биопленки B. cereus чаще всего формируются на границе раздела воздух-жидкость или на твердых поверхностях, таких как стекло. B. cereus демонстрирует флагелярную подвижность, которая, как было показано, способствует образованию биопленок за счет повышенной способности достигать подходящих для этого поверхностей, распространять биопленку на большей площади и привлекать планктонные, то есть свободно плавающие, бактерии. Их жгутики перитрихозные, то есть расположены по всему телу клетки и могут собираться в пучки в одной точке для обеспечения движения. Это свойство жгутиков также позволяет клетке изменять направление движения в зависимости от места сборки жгутиковых филаментов для генерации движения. Некоторые исследования и наблюдения показали, что частицы диоксида кремния размером в несколько нанометров откладываются в слое спорового покрова в экстрацитоплазматической области споры Bacillus cereus. Этот слой был впервые обнаружен с помощью сканирующей просвечивающей электронной микроскопии (STEM), однако полученные изображения не имели достаточного разрешения для определения точного местоположения диоксида кремния. Некоторые исследователи предполагают, что этот слой препятствует слипанию спор. Также было показано, что он обеспечивает некоторую устойчивость к кислым средам. Кремниевая оболочка связана с проницаемостью внутренней мембраны клетки. Сильные минеральные кислоты способны разрушать барьеры проницаемости споры и уничтожать ее. Однако, когда спора покрыта диоксидом кремния, это может снизить проницаемость мембраны и обеспечить устойчивость ко многим кислотам.

B. cereus is a rod shaped bacterium with a Gram positive cell envelope. Depending on the strain, it may be anaerobic or facultatively anaerobic. Most strains are mesophilic, having an optimal temperature between 25 °C and 37 °C, and neutralophilic, preferring neutral pH, but some have been found to grow in environments with much more extreme conditions. These bacteria are both spore forming and biofilm forming, presenting a large challenge to the food industry due to their contamination capability. Biofilms of B. cereus most commonly form on air liquid interfaces or on hard surfaces such as glass. B. cereus display flagellar motility, which has been shown to aid in biofilm formation via an increased ability to reach surfaces suitable for biofilm formation, to spread the biofilm over a larger surface area, and to recruit planktonic, or single, free living bacteria. Their flagella are peritrichous, meaning there are many flagella located all around the cell body that can bundle together at a single location on the cell to propel it. This flagellar property also allows the cell to change directions of movement depending on where on the cell the flagellum filaments come together to generate movement. Some studies and observations have shown that silica particles the size of a few nanometers have been deposited in a spore coat layer in the extracytoplasmic region of the Bacillus cereus spore. The layer was first discovered by the use of scanning transmission electron microscopy (STEM), however the images taken did not have resolution high enough to determine the precise location of the silica. Some investigators hypothesize that the layer helps different spores from sticking together. It has also been shown to provide some resistance to acidic environments. The silica coat is related to the permeability of the cell's inner membrane. Strong mineral acids are able to break down spore permeability barriers and kill the spore. However, when the spore has a silica coating, it may reduce the permeability of the membrane and provide resistance to many acids.

Метаболизм

Bacillus cereus обладает механизмами как аэробного, так и анаэробного дыхания, что делает его факультативным анаэробом. Его аэробный путь состоит из трех терминальных оксидаз: цитохром aa3, цитохром caa3 и цитохром bd, использование каждой из которых зависит от концентрации кислорода в окружающей среде. Геном B. cereus кодирует гены для метаболических ферментов, включая NADH-дегидрогеназы, сукцинатдегидрогеназу, комплекс III и цитохром c-оксидазу, а также другие. Bacillus cereus способен метаболизировать различные соединения для получения энергии, включая углеводы, белки, пептиды и аминокислоты. Анализ основного генома B. cereus выявил ограниченное количество ферментов, предназначенных для расщепления полисахаридов, и преобладание протеаз, а также путей деградации и транспорта аминокислот, что указывает на то, что белки и продукты их распада составляют основу их рациона. Изолят бактерии, способный к производству PHB, был идентифицирован как B. cereus на основе анализа последовательностей 16S рРНК, а также сходства морфологических и биохимических характеристик. PHB могут накапливаться при избытке углерода или недостатке необходимых питательных веществ в окружающей среде и впоследствии расщепляться микроорганизмом в качестве источника энергии в условиях голодания. Это указывает на потенциальную роль B. cereus в производстве биоразлагаемых заменителей пластика. Наибольшая продукция PHB наблюдалась при использовании глюкозы в качестве источника углерода.

Экология

Как и большинство бацилл, наиболее распространенной средой обитания Bacillus cereus является почва. В сочетании с арбускулярной микоризой (и Rhizobium leguminosarum в клевере) они могут усиливать рост растений в почвах, загрязненных тяжелыми металлами, снижая концентрацию этих металлов посредством биоаккумуляции и биотрансформации, а также увеличивая поглощение фосфора, азота и калия некоторыми растениями. Также было показано, что B. cereus способствует выживанию дождевых червей в почвах, загрязненных тяжелыми металлами, в результате использования фунгицидов на основе металлов, что проявляется в увеличении биомассы, размножения и репродуктивной жизнеспособности, а также в снижении содержания металла в тканях инфицированных бактерией организмов. Эти результаты указывают на значительный потенциал применения в экологической биоремедиации. Свидетельства потенциала биоремедиации Bacillus cereus были обнаружены и в водных экосистемах, где органические отходы азота и фосфора, загрязняющие эвтрофическое озеро, разлагались в присутствии B. cereus. B. cereus конкурирует с грамотрицательными бактериями, такими как Salmonella и Campylobacter, в кишечнике; его присутствие снижает количество грамотрицательных бактерий, в частности, благодаря антибиотической активности ферментов, таких как цереины, которые подавляют их способность к кворумному зондированию и проявляют бактерицидное действие. В пищевых животных, таких как куры, кролики и свиньи, некоторые безвредные штаммы B. cereus используются в качестве пробиотической кормовой добавки для снижения количества Salmonella в кишечнике и слепой кишке животных. Это улучшает рост животных, а также повышает безопасность пищевых продуктов для людей, которые их употребляют. Кроме того, B. cereus производит и выделяет ферменты, которые способствуют перевариванию трудноперевариваемых веществ, таких как древесная растительная материя, в кишечнике других организмов. Исследование, проведенное Figueroa López и др., показало, что присутствие этого штамма снижает рост Fusarium verticillioides. Пищевые отравления, вызванные Bacillus, возникают из-за выживания бактериальных эндоспор при употреблении зараженной пищи, которая не была приготовлена должным образом или была приготовлена недостаточно. Температура приготовления ниже или равная 100 °C (212 °F) позволяет некоторым спорам B. cereus выжить. Эта проблема усугубляется неправильным охлаждением пищи, что позволяет эндоспорам прорастать. Приготовленные продукты, не предназначенные для немедленного употребления или быстрого охлаждения, следует хранить при температуре ниже 10 °C (50 °F) или выше 50 °C (122 °F). Было показано, что штаммы Bacillus cytotoxicus растут при температурах до 52 °C (126 °F). Рост бактерий приводит к образованию энтеротоксинов, один из которых обладает высокой устойчивостью к теплу и кислотам (при pH от 2 до 11); попадание внутрь организма вызывает два типа заболеваний: диарейный и эметический (рвотный) синдром. Энтеротоксины, продуцируемые B. cereus, обладают бета-гемолитической активностью. Эметическая форма обычно возникает при употреблении риса, который был приготовлен при недостаточной температуре и времени для уничтожения присутствующих спор, а затем неправильно охлажден. Оставшиеся споры могут производить токсин, цереулид, который не инактивируется последующим нагреванием. Это приводит к тошноте и рвоте через 1–5 часов после употребления. Отличить от других кратковременных бактериальных пищевых интоксикаций, таких как вызванных Staphylococcus aureus, может быть сложно. Считается, что диарейные синдромы, наблюдаемые у пациентов, вызваны тремя токсинами: гемолизином BL (Hbl), негемолитическим энтеротоксином (Nhe) и цитотоксином K (CytK). Гены nhe/hbl/cytK расположены на хромосоме бактерии. Транскрипция этих генов контролируется PlcR. Эти гены также встречаются в таксономически родственных B. thuringiensis и B. anthracis. Эти энтеротоксины производятся в тонком кишечнике хозяина, что препятствует их перевариванию эндогенными ферментами. Токсины Hbl и Nhe являются порообразующими токсинами, тесно связанными с ClyA из E. coli. Белки имеют конформацию, известную как "бета-баррель", которая может внедряться в клеточные мембраны благодаря гидрофобной внешней поверхности, создавая таким образом поры с гидрофильными внутренними частями. Это приводит к потере потенциала клеточной мембраны и, в конечном итоге, к гибели клетки. Ранее считалось, что сроки выработки токсинов определяют различные течения заболевания, но позже было установлено, что эметический синдром вызван токсином цереулидом, который встречается только в эметических штаммах и не входит в "стандартный набор инструментов" B. cereus. Цереулид представляет собой циклический полипептид, содержащий три повтора четырех аминокислот: оксилейцин (Leu) — аланин (Ala) — оксивалин (Val) — валин (valine) (подобно валиномицину, продуцируемому Streptomyces griseus), который синтезируется нерибосомным пептидным синтезом. Считается, что цереулид связывается с 5-гидрокситриптаминовыми 3 (5-HT3) серотониновыми рецепторами, активируя их и приводя к усилению афферентной стимуляции блуждающего нерва. Независимо друг от друга двумя исследовательскими группами было показано, что он кодируется на нескольких плазмидах: pCERE01 или pBCE4810. Плазмида pBCE4810 имеет гомологию с плазмидой вирулентности B. anthracis pXO1, которая кодирует антраксный токсин. Периодонтальные изоляты B. cereus также содержат плазмиды, подобные pXO1. Как и большинство циклических пептидов, содержащих небелковые аминокислоты, цереулид устойчив к нагреванию, протеолизу и кислым условиям. B. cereus также известен как причина хронических кожных инфекций, которые трудно поддаются эрадикации, хотя и менее агрессивных, чем некротизирующий фасциит. B. cereus также может вызывать кератит. Хотя часто ассоциируется с желудочно-кишечными заболеваниями, B. cereus также связан с такими заболеваниями, как молниеносная бактериальная инфекция, поражение центральной нервной системы, инфекции дыхательных путей и эндофтальмит. Эндофтальмит является наиболее распространенной формой экстрагастроинтестинальной патологии, представляющей собой инфекцию глаза, которая может привести к необратимой потере зрения. Инфекции обычно вызывают роговичный кольцевой абсцесс, за которым следуют другие симптомы, такие как боль, проптоз и кровоизлияние в сетчатку. В отличие от B. anthracis, B. cereus содержит некоторые гены токсинов, первоначально обнаруженные в B. anthracis, которые связаны с антракс-подобными инфекциями дыхательных путей. В 2019 году был опубликован случай катетер-ассоциированной бактериемии B. cereus у 91-летнего мужчины, ранее получавшего гемодиализ через PermCath из-за терминальной стадии почечной недостаточности. У него были озноб, тахипноэ и высокая температура, количество лейкоцитов и высокочувствительный C-реактивный белок (CRP) были значительно повышены, а КТ показала аневризму грудного отдела аорты. Аневризма была успешно пролечена внутривенным ванкомицином, пероральными фторхинолонами и удалением PermCath. В 2021 году был опубликован еще один случай инфекции B. cereus у 30-летней женщины с системной красной волчанкой, у которой после установки катетера был диагностирован инфекционный эндокардит. Образцы крови оказались положительными на B. cereus, и пациентка впоследствии была пролечена ванкомицином. ПЦР также использовалась для подтверждения токсинов, которые производит изолят.

Like most Bacilli, the most common ecosystem of Bacillus cereus is the soil. In concert with Arbuscular mycorrhiza (and Rhizobium leguminosarum in clover), they can up regulate plant growth in heavy metal soils by decreasing heavy metal concentrations via bioaccumulation and biotransformation in addition to increasing phosphorus, nitrogen, and potassium uptake in certain plants. B. cereus was also shown to aid in survival of earthworms in heavy metal soils resulting from the use of metal based fungicides, showing increases in biomass, reproduction and reproductive viability, and a decrease in metal content of tissues in those inoculated with the bacterium. These results suggest strong possibilities for its application in ecological bioremediation. Evidence of bioremediation potential by Bacillus cereus was also found in the aquatic ecosystem, where organic nitrogen and phosphorus wastes polluting a eutrophic lake were broken down in the presence of B. cereus. B. cereus competes with Gram negative bacteria species such as Salmonella and Campylobacter in the gut; its presence reduces the number of Gram negative bacteria, specifically via antibiotic activity via enzymes such as cereins that impede their quorum sensing ability and exhibit bactericidal activity. In food animals such as chickens, rabbits and pigs, some harmless strains of B. cereus are used as a probiotic feed additive to reduce Salmonella in the animals' intestines and cecum. This improves the animals' growth, as well as food safety for humans who eat them. In addition, B. cereus create and release enzymes that aid in the digestion of materials that are typically difficult to digest, such as woody plant matter, in the guts of other organisms. A study by Figueroa López et al. showed that the presence of this strain reduced Fusarium verticillioides growth. Bacillus foodborne illnesses occur due to survival of the bacterial endospores when contaminated food is not, or is inadequately, cooked. Cooking temperatures less than or equal to 100 °C (212 °F) allow some B. cereus spores to survive. This problem is compounded when food is then improperly refrigerated, allowing the endospores to germinate. Cooked foods not meant for either immediate consumption or rapid cooling and refrigeration should be kept at temperatures below 10 °C (50 °F) or above 50 °C (122 °F). and Bacillus cytotoxicus strains have been shown to grow at temperatures up to 52 °C (126 °F). Bacterial growth results in production of enterotoxins, one of which is highly resistant to heat and acids (pH levels between 2 and 11); ingestion leads to two types of illness: diarrheal and emetic (vomiting) syndrome. The enterotoxins produced by B. cereus have beta hemolytic activity. The 'emetic' form commonly results from rice which is cooked at a time and temperature insufficient to kill any spores present, then improperly refrigerated. The remaining spores can produce a toxin, cereulide, which is not inactivated by later reheating. This form leads to nausea and vomiting 1–5 hours after consumption. Distinguishing from other short term bacterial foodborne intoxications, such as by Staphylococcus aureus, can be difficult. The diarrhetic syndromes observed in patients are thought to stem from the three toxins: hemolysin BL (Hbl), nonhemolytic enterotoxin (Nhe), and cytotoxin K (CytK). The nhe/hbl/cytK genes are located on the chromosome of the bacteria. Transcription of these genes is controlled by PlcR. These genes occur in the taxonomically related B. thuringiensis and B. anthracis, as well. These enterotoxins are all produced in the small intestine of the host, thus thwarting digestion by host endogenous enzymes. The Hbl and Nhe toxins are pore forming toxins closely related to ClyA of E. coli. The proteins exhibit a conformation known as a "beta barrel" that can insert into cellular membranes due to a hydrophobic exterior, thus creating pores with hydrophilic interiors. The effect is loss of cellular membrane potential and eventually cell death. Previously, it was thought that the timing of the toxin production was responsible for the two different courses of disease, but it has since been found that the emetic syndrome is caused by the toxin cereulide, which is found only in emetic strains and is not part of the "standard toolbox" of B. cereus. Cereulide is a cyclic polypeptide containing three repeats of four amino acids: oxy Leucine (Leu)— Alanine (Ala)— oxy Valine (Val)— Val (valine) (similar to valinomycin produced by Streptomyces griseus) produced by nonribosomal peptide synthesis. Cereulide is believed to bind to 5 hydroxytryptamine 3 (5 HT3) serotonin receptors, activating them and leading to increased afferent vagus nerve stimulation. It was shown independently by two research groups to be encoded on multiple plasmids: pCERE01 or pBCE4810. Plasmid pBCE4810 shares homology with the B. anthracis virulence plasmid pXO1, which encodes the anthrax toxin. Periodontal isolates of B. cereus also possess distinct pXO1 like plasmids. Like most of cyclic peptides containing nonproteogenic amino acids, cereulide is resistant to heat, proteolysis, and acid conditions. B. cereus is also known to cause difficult to eradicate chronic skin infections, though less aggressive than necrotizing fasciitis. B. cereus can also cause keratitis. While often associated with gastrointestinal illness, B. cereus is also associated with illnesses such as fulminant bacterial infection, central nervous system involvement, respiratory tract infection, and endophthalmitis. Endophthalmitis is the most common form of extra gastrointestinal pathogenesis, which is an infection of the eye that may cause permanent vision loss. Infections typically cause a corneal ring abscess, followed by other symptoms such as pain, proptosis, and retinal hemorrhage. While different from B. anthracis, B. cereus contains some toxin genes originally found in B. anthracis that are attributed to anthrax like respiratory tract infections. A case study was published in 2019 of a catheter related bloodstream infection of B. cereus in a 91 year old male previously being treated with hemodialysis via PermCath for end stage renal disease. He presented with chills, tachypnea, and high grade fever, his white blood cell count and high sensitivity C reactive protein (CRP) were significantly elevated, and CT imaging revealed a thoracic aortic aneurysm. He was successfully treated for the aneurysm with intravenous vancomycin, oral fluoroquinolones, and PermCath removal. Another case study of B. cereus infection was published in 2021 of a 30 year old woman with lupus who was diagnosed with infective endocarditis after receiving a catheter. The blood samples were positive for B. cereus and the patient was subsequently treated with vancomycin. PCR was also used to verify toxins that the isolate produces.

Диагноз

В случае пищевого отравления диагноз *Bacillus cereus* может быть подтвержден выделением более 100 000 микроорганизмов *B. cereus* на грамм из продукта, эпидемиологически связанного с заболеванием, однако такое тестирование часто не проводится, поскольку заболевание относительно нетяжелое и обычно проходит самостоятельно.

Прогноз

Большинство пациентов с рвотой выздоравливают в течение 6–24 часов. В 2014 году у 23 новорожденных в Великобритании, получавших полное парентеральное питание, загрязненное B. cereus, развился сепсис, причем трое из младенцев позже умерли в результате инфекции.

Профилактика

В то время как вегетативные клетки B. cereus погибают при обычной кулинарной обработке, споры более устойчивы. Жизнеспособные споры в пище могут прорастать в вегетативные клетки в кишечнике и производить ряд энтеротоксинов, вызывающих диарею, поэтому удаление спор является желательным. При влажной тепловой обработке (припускание, кипячение, тушение, томление, тушение в горшке, приготовление на пару) для уничтожения спор требуется более 5 минут при 121 °C (250 °F) в самой холодной точке продукта. При сухой тепловой обработке (жарка на гриле, запекание, выпечка, обжаривание, припекание, обжаривание в сковороде) 120 °C (248 °F) в течение 1 часа убивает все споры на поверхности. Этот процесс удаления спор очень важен, поскольку споры B. cereus особенно устойчивы, даже после пастеризации или воздействия гамма-излучения. Исследование изолята Bacillus cereus, выделенного из желудка овцы, показало, что он способен расщеплять β-циперметрин, или β-CY, который известен как антимикробный агент. Этот штамм, известный как GW 01, может расщеплять β-CY со значительной скоростью, когда концентрация бактериальных клеток высока относительно концентрации антимикробного агента. Также было отмечено, что способность к расщеплению β-CY является индуцируемой. Однако, по мере увеличения концентрации β-CY, скорость деградации β-CY снижается. Это указывает на то, что агент также действует как токсин по отношению к штамму GW 01. Это имеет значение, поскольку показывает, что при определенных концентрациях β-CY может использоваться в качестве антимикробного средства против Bacillus cereus.

Болезни водных животных

Группы Bacillus cereus, в особенности B. cereus (Bc) и B. thuringiensis (Bt), также патогенны для множества водных организмов, включая китайскую мягкопанцирную черепаху (Pelodiscus sinensis), вызывая инфекцию, характеризующуюся выраженными поражениями, такими как застой в печени и увеличение селезенки, что приводит к высокой смертности.

Бактериофаги

Бактерии группы B. cereus инфицируются бактериофагами, принадлежащими к семейству Tectiviridae. Это семейство включает безхвостые фаги, которые характеризуются наличием липидной мембраны или везикулы под икосаэдрической белковой оболочкой и состоят примерно из равных частей белков, кодируемых вирусом, и липидов, происходящих из плазматической мембраны клетки-хозяина. Во время инфекции липидная мембрана преобразуется в структуру, подобную хвосту, используемую для доставки генома. Геном состоит примерно из 15 килобаз, представляет собой линейную двухцепочечную ДНК (dsDNA) с длинными инвертированными терминальными повторами (100 пар оснований). GIL01, Bam35, GIL16, AP50 и Wip1 – примеры умеренных тективирусов, инфицирующих группу B. cereus.