Рибонуклеаза H: структура, функции и эволюционные аспекты.

Введение

Семейство ферментов Рибонуклеаза H (сокращенно RNase H или RNH) — это семейство неспецифических эндонуклеаз, катализирующих расщепление РНК в РНК/ДНК-субстрате посредством гидролитического механизма. Представители семейства RNase H встречаются почти во всех организмах, от бактерий до архей и эукариот. Семейство подразделяется на эволюционно связанные группы с несколько различными предпочтениями к субстратам, обычно обозначаемые как рибонуклеазы H1 и H2. Геном человека кодирует как H1, так и H2. Рибонуклеаза H2 человека представляет собой гетеротримерный комплекс, состоящий из трех субъединиц, мутации в любой из которых являются одной из генетических причин редкого заболевания, известного как синдром Айкарди-Гутье. В то время как H1 и H2 присутствуют во всех доменах жизни. У эукариот рибонуклеаза H1 участвует в репликации ДНК митохондриального генома. И H1, и H2 вовлечены в поддержание генома, например, в обработке R-циклов. RNase H были предложены как представители эволюционно связанного сверхсемейства, включающего другие нуклеазы и ферменты, участвующие в обработке нуклеиновых кислот, такие как ретровирусные интегразы, ДНК-транспозазы, резольвазы перекрестков Холлидея, белки Piwi и Argonaute, различные экзонуклеазы и сплайсосомный белок Prp8. RNase H можно разделить на два подтипа, H1 и H2, которым по историческим причинам присваиваются арабские числовые обозначения у эукариот и римские числовые обозначения у прокариот. Таким образом, RNase HI Escherichia coli является гомологом RNase H1 Homo sapiens. Все RNase H имеют активный центр, сосредоточенный вокруг консервативного последовательного мотива, состоящего из остатков аспартата и глутамата, часто называемого мотивом DEDD. Эти остатки взаимодействуют с ионами магния, необходимыми для катализа. В то время как все представители группы H1 и прокариотические представители группы H2 функционируют как мономеры, эукариотические ферменты H2 являются облигатными гетеротримерами. В группе H1 выявлена связь между более высоким сродством к субстрату и наличием структурных элементов, состоящих из альфа-спирали и гибкой петли, обеспечивающих большую и более основную поверхность связывания с субстратом. C-спираль имеет неравномерное таксономическое распространение: она присутствует в гомологах E. coli и человеческой RNase H1, но отсутствует в домене RNase H ВИЧ, хотя существуют примеры ретровирусных доменов, содержащих C-спираль.

Enzyme family

Ribonuclease H (abbreviated RNase H or RNH) is a family of non sequence specific endonuclease enzymes that catalyze the cleavage of RNA in an RNA/DNA substrate via a hydrolytic mechanism. Members of the RNase H family can be found in nearly all organisms, from bacteria to archaea to eukaryotes. The family is divided into evolutionarily related groups with slightly different substrate preferences, broadly designated ribonuclease H1 and H2. The human genome encodes both H1 and H2. Human ribonuclease H2 is a heterotrimeric complex composed of three subunits, mutations in any of which are among the genetic causes of a rare disease known as Aicardi–Goutières syndrome. whereas H1 and H2 occur in all domains of life. In eukaryotes, ribonuclease H1 is involved in DNA replication of the mitochondrial genome. Both H1 and H2 are involved in genome maintenance tasks such as processing of R loop structures. RNases H have been proposed as members of an evolutionarily related superfamily encompassing other nucleases and nucleic acid processing enzymes such as retroviral integrases, DNA transposases, Holliday junction resolvases, Piwi and Argonaute proteins, various exonucleases, and the spliceosomal protein Prp8. RNases H can be broadly divided into two subtypes, H1 and H2, which for historical reasons are given Arabic numeral designations in eukaryotes and Roman numeral designations in prokaryotes. Thus the Escherichia coli RNase HI is a homolog of the Homo sapiens RNase H1. All RNases H have an active site centered on a conserved sequence motif composed of aspartate and glutamate residues, often referred to as the DEDD motif. These residues interact with catalytically required magnesium ions. While all members of the H1 group and the prokaryotic members of the H2 group function as monomers, eukaryotic H2 enzymes are obligate heterotrimers. Within the H1 group, a relationship has been identified between higher substrate binding affinity and the presence of structural elements consisting of a helix and flexible loop providing a larger and more basic substrate binding surface. The C helix has a scattered taxonomic distribution; it is present in the E. coli and human RNase H1 homologs and absent in the HIV RNase H domain, but examples of retroviral domains with C helices do exist.

Функция

Ферменты рибонуклеазы H расщепляют фосфодиэстерные связи РНК в двухцепочечном гибриде РНК:ДНК, оставляя 3'-гидроксильную и 5'-фосфатную группы на обоих концах места расщепления посредством механизма катализа с участием двух металлических ионов, в котором два двухвалентных катиона, таких как Mg2+ и Mn2+, непосредственно участвуют в каталитической функции. Рибонуклеазы H типа 1 включают прокариотические и эукариотические рибонуклеазы H1 и ретровирусные рибонуклеазы H. Рибонуклеазы H типа 2 включают прокариотические и эукариотические рибонуклеазы H2 и бактериальные рибонуклеазы H3. Эти рибонуклеазы H существуют в мономерной форме, за исключением эукариотических рибонуклеаз H2, которые существуют в гетеротримерной форме. Рибонуклеазы H1 и H2 имеют различные предпочтения к субстрату и различные, но перекрывающиеся функции в клетке. У прокариот и низших эукариот ни один из ферментов не является жизненно необходимым, в то время как оба считаются жизненно необходимыми у высших эукариот.

Рибонуклеаза H1

Для ферментов рибонуклеазы H1 требуется как минимум четыре рибонуклеотид-содержащие пары оснований в субстрате, и они не способны удалить единственный рибонуклеотид из цепи, состоящей в основном из дезоксирибонуклеотидов. По этой причине маловероятно, что ферменты RNase H1 участвуют в процессинге РНК-праймеров из фрагментов Оказаки во время репликации ДНК. У многих эукариот, включая млекопитающих, гены RNase H1 содержат митохондриальную сигнальную последовательность, что приводит к экспрессии изоформ как с MTS, так и без нее. В результате RNase H1 локализуется как в митохондриях, так и в ядре. В моделях нокаута мышей мутанты с делецией гена RNase H1 нежизнеспособны на стадии эмбриогенеза из-за дефектов репликации митохондриальной ДНК. Дефекты репликации митохондриальной ДНК, вызванные отсутствием RNase H1, вероятно, обусловлены нарушениями процессинга R-петель. Субъединица B опосредует белок-белковые взаимодействия между комплексом H2 и PCNA, что обеспечивает локализацию H2 в фокусах репликации. Хотя и H1, и H2 присутствуют в ядре клеток млекопитающих, H2 является основным источником RNase H-активности там и играет важную роль в поддержании стабильности генома. В отличие от HI и HII, которые широко распространены среди прокариот, HIII встречается лишь у немногих организмов с прерывистым таксономическим распределением; он несколько более распространен у архей и редко или никогда не обнаруживается в одном и том же прокариотическом геноме с HI.

Механизм

Активный центр почти всех RNase H содержит четыре отрицательно заряженных аминокислотных остатка, известных как мотив DEDD; часто также присутствует гистидин, например, в ВИЧ-1, у человека или E. coli. Согласно экспериментальным данным и компьютерному моделированию, фермент активирует молекулу воды, связанную с одним из ионов металла, при участии консервированного гистидина. Переходное состояние носит ассоциативный характер и формирует промежуточное соединение с протонированным фосфатом и депротонированной алкоксидной группой.

Роль в болезни

В небольших исследованиях мутации в человеческой RNase H1 были связаны с хронической прогрессирующей внешней офтальмоплегией, обычной характеристикой митохондриальных заболеваний. Симптомы АГС тесно напоминают симптомы врожденной вирусной инфекции и связаны с неадекватной гиперэкспрессией интерферона I типа. АГС также может быть вызвана мутациями в других генах: TREX1, SAMHD1, ADAR и MDA5/IFIH1, все из которых участвуют в процессах обработки нуклеиновых кислот. Характеристика распределения мутаций в популяции пациентов с АГС выявила 5% всех мутаций АГС в RNASEH2A, 36% в 2B и 12% в 2C. Две группы вирусов используют обратную транскрипцию как часть своего жизненного цикла: ретровирусы, кодирующие свои геномы в одноцепочечной РНК и реплицирующиеся через двухцепочечный ДНК-промежуточный продукт; и вирусы dsDNA RT, реплицирующие свои двухцепочечные геномы ДНК через РНК "прегеном"-промежуточный продукт. Патогенными примерами являются вирус иммунодефицита человека и вирус гепатита B соответственно. Оба кодируют крупные многофункциональные белки обратной транскриптазы (РТ), содержащие домены RNase H. Ретровирусные белки РТ от ВИЧ-1 и вируса мышиной лейкемии являются наиболее изученными представителями этого семейства. Ретровирусная РТ отвечает за преобразование одноцепочечного РНК-генома вируса в двухцепочечную ДНК. Этот процесс требует трех этапов: во-первых, РНК-зависимая ДНК-полимеразная активность производит минус-цепочку ДНК из плюс-цепочечного РНК-шаблона, генерируя гибридный РНК:ДНК-промежуточный продукт; во-вторых, РНК-цепочка разрушается; и в-третьих, ДНК-зависимая ДНК-полимеразная активность синтезирует плюс-цепочку ДНК, генерируя двухцепочечную ДНК как конечный продукт. Второй этап этого процесса осуществляется доменом RNase H, расположенным в C-конце белка РТ. RNase H выполняет три типа расщепляющих действий: неспецифическую деградацию плюс-цепочечного РНК-генома, специфическое удаление минус-цепочечного тРНК-праймера и удаление плюс-цепочечного полипуринового тракта (PPT), богатого пуринами. RNase H играет роль в инициации синтеза плюс-цепочки, но не в обычном методе синтеза новой праймерной последовательности. Скорее, RNase H создает "праймер" из PPT, устойчивый к расщеплению RNase H. Удаляя все основания, кроме PPT, PPT используется в качестве маркера конца U3-области его длинного концевого повтора. Ингибиторы обратной транскриптазы, специфически ингибирующие полимеразную функцию РТ, широко используются в клинической практике, но ингибиторы функции RNase H отсутствуют; это единственная ферментативная функция, кодируемая ВИЧ, которая пока не является мишенью для лекарственных препаратов, используемых в клинической практике.

In small studies, mutations in human RNase H1 have been associated with chronic progressive external ophthalmoplegia, a common feature of mitochondrial disease. The symptoms of AGS closely resemble those of congenital viral infection and are associated with inappropriate upregulation of type I interferon. AGS can also be caused by mutations in other genes: TREX1, SAMHD1, ADAR, and MDA5/IFIH1, all of which are involved in nucleic acid processing. Characterization of mutational distribution in an AGS patient population found 5% of all AGS mutations in RNASEH2A, 36% in 2B, and 12% in 2C.]] Two groups of viruses use reverse transcription as part of their life cycles: retroviruses, which encode their genomes in single stranded RNA and replicate through a double stranded DNA intermediate; and dsDNA RT viruses, which replicate their double stranded DNA genomes through an RNA "pregenome" intermediate. Pathogenic examples include human immunodeficiency virus and hepatitis B virus, respectively. Both encode large multifunctional reverse transcriptase (RT) proteins containing RNase H domains. Retroviral RT proteins from HIV 1 and murine leukemia virus are the best studied members of the family. Retroviral RT is responsible for converting the virus' single stranded RNA genome into double stranded DNA. This process requires three steps: first, RNA dependent DNA polymerase activity produces minus strand DNA from the plus strand RNA template, generating an RNA:DNA hybrid intermediate; second, the RNA strand is destroyed; and third, DNA dependent DNA polymerase activity synthesizes plus strand DNA, generating double stranded DNA as the final product. The second step of this process is carried out by an RNase H domain located at the C terminus of the RT protein. RNase H performs three types of cleaving actions: non specific degradation of the plus strand RNA genome, specific removal of the minus strand tRNA primer, and removal of the plus strand purine rich polypurine tract (PPT) primer. RNase H plays a role in the priming of the plus strand, but not in the conventional method of synthesizing a new primer sequence. Rather RNase H creates a "primer" from the PPT that is resistant to RNase H cleavage. By removing all bases but the PPT, the PPT is used as a marker for the end of the U3 region of its long terminal repeat. Reverse transcriptase inhibitors that specifically inhibit the polymerase function of RT are in widespread clinical use, but not inhibitors of the RNase H function; it is the only enzymatic function encoded by HIV that is not yet targeted by drugs in clinical use.

Эволюция

РНАзы H широко распространены и встречаются во всех доменах жизни. Это семейство принадлежит к более крупному суперсемейству нуклеазных ферментов. В прокариотических геномах часто присутствуют несколько генов RNase H, однако наблюдается небольшая корреляция между наличием генов HI, HII и HIII и общими филогенетическими связями, что позволяет предположить, что горизонтальный перенос генов мог сыграть роль в определении распространения этих ферментов. РНАзы HI и HIII редко или никогда не встречаются в одном и том же прокариотическом геноме. Если геном организма содержит более одного гена RNase H, они иногда демонстрируют значительные различия в уровне активности. Эти наблюдения позволяют предположить наличие эволюционной модели, которая минимизирует функциональную избыточность между генами RNase H. Эволюционная траектория RNase H2 у эукариот, особенно механизм, посредством которого эукариотические гомологи стали облигатными гетеротримерами, остается неясной; субъединицы B и C не имеют очевидных гомологов у прокариот. Для обнаружения могут использоваться высокочувствительные методы, такие как поверхностный плазмонный резонанс. RNase HII может быть использована для деградации РНК-праймера фрагмента Оказаки или для введения одноцепочечных разрывов в позициях, содержащих рибонуклеотид. Важно отметить, что ингибитор рибонуклеазы, обычно используемый в качестве реагента, неэффективен для ингибирования активности как HI, так и HII. Активность RNase H была впоследствии обнаружена в E. coli и в образце онковирусов с РНК-геномами в ходе ранних исследований вирусной обратной транскрипции. Позже стало ясно, что экстракт телячьей тимуса содержит более одного белка с активностью RNase H, а E. coli содержит два гена RNase H. Изначально фермент, ныне известный как RNase H2 у эукариот, был обозначен как H1 и наоборот, но названия эукариотических ферментов были изменены в соответствии с названиями у E. coli для облегчения сравнительного анализа, что привело к современной номенклатуре, в которой прокариотические ферменты обозначаются римскими цифрами, а эукариотические – арабскими. Прокариотическая RNase HIII, о которой было сообщено в 1999 году, была последним идентифицированным подтипом RNase H. Гомолог белка E. coli от S. cerevisiae (то есть субъединица H2A) был легко идентифицирован с помощью биоинформатики при секвенировании генома дрожжей, но было обнаружено, что соответствующий белок не проявляет ферментативной активности в изоляции. Однако субъединицы B и C дрожжей имеют очень низкий процент идентичности последовательностей по сравнению с их гомологами в других организмах, и соответствующие человеческие белки были окончательно идентифицированы только после обнаружения мутаций во всех трех, вызывающих синдром Айкарди-Гутье.

RNases H are widely distributed and occur in all domains of life. The family belongs to a larger superfamily of nuclease enzymes In prokaryotic genomes, multiple RNase H genes are often present, but there is little correlation between occurrence of HI, HII, and HIII genes and overall phylogenetic relationships, suggesting that horizontal gene transfer may have played a role in establishing the distribution of these enzymes. RNase HI and HIII rarely or never appear in the same prokaryotic genome. When an organism's genome contains more than one RNase H gene, they sometimes have significant differences in activity level. These observations have been suggested to reflect an evolutionary pattern that minimizes functional redundancy among RNase H genes. The evolutionary trajectory of RNase H2 in eukaryotes, especially the mechanism by which eukaryotic homologs became obligate heterotrimers, is unclear; the B and C subunits have no apparent homologs in prokaryotes. Highly sensitive techniques such as surface plasmon resonance can be used for detection. RNase HII can be used to degrade the RNA primer component of an Okazaki fragment or to introduce single stranded nicks at positions containing a ribonucleotide. Of note, the ribonuclease inhibitor protein commonly used as a reagent is not effective at inhibiting the activity of either HI or HII. RNase H activity was subsequently discovered in E. coli and in a sample of oncoviruses with RNA genomes during early studies of viral reverse transcription. It later became clear that calf thymus extract contained more than one protein with RNase H activity and that E. coli contained two RNase H genes. Originally, the enzyme now known as RNase H2 in eukaryotes was designated H1 and vice versa, but the names of the eukaryotic enzymes were switched to match those in E. coli to facilitate comparative analysis, yielding the modern nomenclature in which the prokaryotic enzymes are designated with Roman numerals and the eukaryotic enzymes with Arabic numerals. The prokaryotic RNase HIII, reported in 1999, was the last RNase H subtype to be identified. The S. cerevisiae homolog of the E. coli protein (that is, the H2A subunit) was easily identifiable by bioinformatics when the yeast genome was sequenced, but the corresponding protein was found not to have enzymatic activity in isolation. However, the yeast B and C subunits have very low sequence identity to their homologs in other organisms, and the corresponding human proteins were conclusively identified only after mutations in all three were found to cause Aicardi–Goutières syndrome.