Введение

Запертая нуклеиновая кислота (LNA), также известная как мостовая нуклеиновая кислота (BNA) и часто называемая недоступной для расщепления РНК, является модифицированным нуклеотидом РНК, в котором рибозный фрагмент модифицирован дополнительным мостиком, соединяющим 2'-кислород и 4'-углерод. Этот мостик "фиксирует" рибозу в 3'-эндоконформации (северной конформации), которая часто встречается в дуплексах типа А. Эта структура обеспечивает повышенную устойчивость к ферментативному разложению. LNA также обладает улучшенной специфичностью и аффинностью при спаривании оснований, выступая в качестве мономера или компонента олигонуклеотида. Нуклеотиды LNA могут быть смешаны с остатками ДНК или РНК в составе олигонуклеотида.

Синтез

Обьика и др. впервые химически синтезировали LNA в 1997 году, а за ними, независимо, группа Джеспера Венгела в 1998 году. На сегодняшний день показано, что два различных подхода, известные как линейная и конвергентная стратегии, позволяют получать LNA с высоким выходом и эффективностью. Линейная стратегия синтеза была впервые подробно описана в работах Обьики и др. Добавление различных заместителей остаётся возможным при сохранении ключевых физико-химических свойств, таких как высокая аффинность и специфичность, присущих первоначально синтезированной LNA. Такие олигомеры синтезируются химическим путём и доступны в продаже.

Инкорпорация в ДНК/РНК

ЛНА может включаться в ДНК и РНК благодаря нестрогой специфичности некоторых ДНК и РНК-полимераз. ДНК-полимераза Phusion, коммерчески разработанный фермент на основе ДНК-полимеразы Pfu, эффективно включает ЛНА в ДНК.

Свойства

LNA обеспечивает повышенную биостабильность по сравнению с биологическими нуклеиновыми кислотами. Олигонуклеотиды, модифицированные LNA, демонстрируют улучшенные термодинамические характеристики при гибридизации с РНК, одноцепочечной ДНК (ssDNA) и двухцепочечной ДНК (dsDNA). Однако, они проявляют более эффективный гидролиз фосфодиэфирных связей по сравнению с немодифицированными аналогами. Модификация распознающих участков ДНК-зимов мономерами LNA приводит к образованию LNA-зима, который распознает коксакивирус A21 (CAV 21) и расщепляет его РНК-мишень, аналогичную последовательности в 5'-нетранслируемой области (5' UTR) человеческого риновируса 14 (HRV 14) – последовательности, не распознаваемой немодифицированными ДНК-зимами.

Терапевтические средства

Использование олигонуклеотидов на основе LNA в терапевтических целях – развивающаяся область в биотехнологии. Различные олигонуклеотиды LNA были изучены с точки зрения их фармакокинетики и токсичности. Исследования показали, что токсичность LNA, как правило, не зависит от последовательности олигонуклеотида и демонстрирует благоприятный профиль безопасности для применения в терапевтической практике. LNA также был использован в препарате Miravirsen, экспериментальном средстве для лечения гепатита С, представляющем собой 15-нуклеотидную фосфоротиоатную последовательность со специфическим связыванием с MiR 122 (микроРНК, экспрессируемой в гепатоцитах).

Выявление и диагностика

Аллель-специфическая ПЦР с использованием LNA позволяет разрабатывать более короткие праймеры, не снижая специфичность связывания. LNA была применена в флуоресцентной гибридизации in situ (FISH). FISH – это распространенный метод визуализации генетического материала в различных клетках, однако исследования показали, что эффективность гибридизации зондов является ограничивающим фактором для этого метода. В то же время, зонды, содержащие LNA, продемонстрировали повышенную эффективность гибридизации как с ДНК, так и с РНК. Улучшенная эффективность FISH с использованием LNA позволила проводить анализ FISH человеческих хромосом, различных типов нечеловеческих клеток и микромассивов.