Выращивание микроорганизмов в контролируемой среде

Введение

Метод размножения микроорганизмов в контролируемой среде

Микробиологическая культура, или микробная культура, – это метод увеличения числа микроорганизмов путем обеспечения их размножения в заранее определенной питательной среде в контролируемых лабораторных условиях. Микробные культуры являются основополагающими и базовыми диагностическими методами, используемыми в качестве исследовательских инструментов в молекулярной биологии. Термин "культура" также может относиться к выращиваемым микроорганизмам. Микробные культуры используются для определения типа организма, его количества в исследуемом образце или обоих параметров. Это один из основных диагностических методов микробиологии, применяемый для определения причины инфекционных заболеваний путем обеспечения размножения возбудителя в заранее определенной среде. Например, мазок из горла получают путем соскоба слизистой оболочки задней стенки глотки и переноса образца в питательную среду для выявления вредных микроорганизмов, таких как Streptococcus pyogenes – возбудитель стрептококкового фарингита. Кроме того, термин "культура" в более широком смысле используется неформально для обозначения "селективного выращивания" определенного вида микроорганизма в лаборатории. Часто необходимо получить чистую культуру микроорганизмов. Чистая (или аксеническая) культура – это популяция клеток или многоклеточных организмов, растущих в отсутствие других видов или типов. Чистая культура может происходить из одной клетки или одного организма, в этом случае клетки являются генетическими клонами друг друга. Для получения гелеобразной среды для микробиологической культуры используется агарозный гель (агар). Агар – это желатиноподобное вещество, получаемое из морских водорослей. Более дешевой заменой агара является гуаровая камедь, которую можно использовать для изоляции и поддержания термофилов.

История

Первым типом питательной среды была жидкая среда, разработанная Луи Пастером в 1860 году. Она использовалась в лаборатории до тех пор, пока Роберт Кох не разработал твердую среду в 1881 году. Метод Коха, использовавший плоскую чашку для твердой среды, был заменен круглой коробкой, предложенной Джулиусом Ричардом Петри в 1887 году. Чтобы получить чистую прокариотическую культуру, необходимо начинать культивирование с одной клетки или одной колонии организма. Поскольку прокариотическая колония является бесполым потомством одной клетки, все клетки в ней генетически идентичны и приводят к получению чистой культуры.

Вирусная культура

Культуры вирусов и фагов требуют клеток-хозяев, в которых вирус или фаг размножаются. Для бактериофагов культуры выращивают, заражая бактериальные клетки. Затем фаг можно выделить из образовавшихся бляшек в сплошном нарастании бактерий на чашке Петри. Вирусные культуры получают из соответствующих эукариотических клеток-хозяев. Метод нанесения штрихов на чашку Петри – это способ физического разделения микробной популяции, который заключается в распределении инокулята вперед и назад с помощью инокуляционной петли по твердой агарной среде. После инкубации образуются колонии, и отдельные клетки оказываются изолированными от биомассы. После того, как микроорганизм был изолирован в чистой культуре, необходимо сохранить его в жизнеспособном состоянии для дальнейшего изучения и использования в так называемых исходных культурах. Эти культуры необходимо поддерживать таким образом, чтобы не происходило потери их биологических, иммунологических и культуральных свойств.

Культура эукариотических клеток

Культуры эукариотических клеток обеспечивают контролируемую среду для изучения эукариотических организмов. Одноклеточные эукариоты, такие как дрожжи, водоросли и простейшие, могут культивироваться схожим образом с прокариотическими культурами. То же самое справедливо и для многоклеточных микроскопических эукариот, таких как C. elegans. Хотя макроскопические эукариотические организмы слишком велики для культивирования в лаборатории, клетки, полученные из этих организмов, можно культивировать. Это позволяет исследователям изучать отдельные части и процессы макроскопического эукариота in vitro.

Жидкие культуры

Одним из методов микробиологического культивирования является жидкая культура, при которой желаемые организмы суспендируются в жидкой питательной среде, такой как бульон Лурии, в вертикальной колбе. Это позволяет исследователю получить большое количество бактерий или других микроорганизмов для различных последующих применений. Жидкие культуры идеально подходят для подготовки антимикробного анализа, в котором жидкий бульон инокулируется бактериями и оставляется расти в течение ночи (для механического перемешивания бульона может использоваться шейкер, чтобы обеспечить равномерный рост). Впоследствии отбираются аликвоты образца для тестирования антимикробной активности конкретного препарата или белка (антимикробных пептидов). В качестве альтернативы могут использоваться статические жидкие культуры. Эти культуры не перемешиваются, и они создают для микробов градиент кислорода.

Агарные пластины

Микробиологические культуры можно выращивать в чашках Петри различных размеров с тонким слоем питательной среды на основе агара. После инокуляции питательной среды в чашке Петри желаемыми бактериями, чашки инкубируют при оптимальной температуре для роста выбранных бактерий (например, обычно при 37 градусах Цельсия, или температуре тела человека, для культур, полученных от людей или животных, или при более низкой температуре для культур из окружающей среды). После достижения необходимого уровня роста, агаровые пластины можно хранить в холодильнике перевернутыми в течение длительного времени для сохранения бактерий для дальнейших экспериментов. В агар можно добавлять различные добавки перед заливкой в чашку и его затвердеванием. Некоторые виды бактерий могут расти только в присутствии определенных добавок. Это также используется при создании генетически модифицированных штаммов бактерий, содержащих ген устойчивости к антибиотикам. При добавлении выбранного антибиотика в агар, расти смогут только бактериальные клетки, содержащие вставленный ген, обеспечивающий устойчивость. Это позволяет исследователю отбирать только успешно трансформированные колонии.

Измерительные палочки на основе агара

Миниатюризированные агар-пластинки, реализованные в формате тест-полосок, например, Dip Slide и Digital Dipstick, обладают потенциалом для использования в условиях оказания медицинской помощи в диагностических целях. Они имеют преимущества перед традиционными агар-пластинами, поскольку являются экономически выгодными и не требуют специальных навыков или лабораторных условий для работы, что позволяет использовать их непосредственно в месте оказания помощи.

Селективные и дифференциальные среды

Селективные и дифференциальные среды позволяют выявить характеристики культивируемых на них микроорганизмов. Такие среды могут быть селективными, дифференциальными или одновременно селективными и дифференциальными. Выращивание культуры на различных селективных и дифференциальных средах позволяет очистить смешанные культуры и предоставить ученым информацию, необходимую для идентификации неизвестных культур.

Селективные средства

Селективные среды используются для дифференциации организмов, позволяя определённому виду расти на них, подавляя при этом рост других. Например, эозин метиленовый синий (EMB) может быть использован для подавления роста грамположительных бактерий, большинство из которых растут на EMB затруднённо, и для стимулирования роста грамотрицательных бактерий, рост которых на EMB не ингибируется.

Дифференциальные среды

Ученые используют дифференциальные среды при культивировании микроорганизмов для выявления определенных биохимических свойств этих организмов. Эти выявленные свойства затем сравниваются с характеристиками известных микроорганизмов, чтобы идентифицировать неизвестные культуры. Примером является агар МакКонки (MAC), который позволяет выявить бактерии, ферментирующие лактозу, благодаря pH-индикатору, меняющему цвет при образовании кислот в процессе ферментации.

Многоцелевые панели

На многоцелевых панелях бактерии, выделенные из ранее выращенной колонии, распределяются в каждый колодец, который содержит питательную среду, а также компоненты для биохимического теста, изменяющего оптическую плотность колодца в зависимости от тестируемого свойства бактерий. Панель инкубируется в приборе, который затем анализирует каждый колодец с использованием светового метода, такого как колориметрия, турбидиметрия или флюорометрия. Полученные результаты автоматически сравниваются с базой данных известных результатов для различных видов бактерий, чтобы установить, какие виды бактерий присутствуют в данной панели. Одновременно проводится тестирование чувствительности к антибиотикам.

Культуры стержней

Культуры в пробирках похожи на агарные пластинки, но формируются из твердого агара в пробирке. Бактерии вводятся с помощью инокуляционной петли или наконечника пипетки, которым прокалывают агар в центре. Бактерии растут в месте прокола. Культуры в пробирках чаще всего используются для кратковременного хранения или транспортировки культур. Кроме того, культуры в пробирках могут выявить характеристики культивируемых микроорганизмов, такие как подвижность или требования к кислороду.

Твердая культура термофильных микроорганизмов

Для твердых пластинчатых культур термофильных микроорганизмов, таких как Bacillus acidocaldarius, Bacillus stearothermophilus, Thermus aquaticus и Thermus thermophilus и т.д., растущих при температурах от 50 до 70 градусов Цельсия, низкоацилированная очищенная геллановая камедь доказала свою эффективность в качестве предпочтительного гелеобразователя по сравнению с агаром для подсчета, изоляции или одновременного подсчета и изоляции вышеуказанных термофильных бактерий.

Коллекции клеточных культур

Коллекции микробиологических культур специализируются на приобретении, аутентификации, производстве, сохранении, каталогизации и распространении жизнеспособных культур стандартных эталонных микроорганизмов, клеточных линий и других материалов для исследований в области микробиологической систематики. Коллекции культур также являются хранилищами типовых штаммов. + Основные национальные коллекции культур.

Коллекция | Акроним | Название | Местонахождение
---|---|---|---
ATCC | Американская коллекция типовых культур | Manassas, Вирджиния
BCCM | Бельгийские координированные коллекции микроорганизмов | Децентрализованная координационная ячейка в Брюсселе, Бельгия
CCUG | Culture Collection Университета Гетеборга | Гетеборг, Швеция
CECT | Colección Española de Cultivos Tipo | Валенсия, Испания
CIP | Collection d'Institut Pasteur | Париж, Франция
DSMZ | Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen | Брауншвейг, Германия
NCPPB | Национальная коллекция патогенных бактерий растений | Йорк, Великобритания
ICMP | Международная коллекция микроорганизмов растений | Окленд, Новая Зеландия
JCM | Японская коллекция микроорганизмов | Цукуба, Ибараки, Япония
NCTC | Национальная коллекция типовых культур | Лондон, Англия, Великобритания
NCIMB | Национальная коллекция промышленных, пищевых и морских бактерий | Абердин, Шотландия
NCPPB | Национальная коллекция патогенных бактерий растений | Йорк, Англия