Введение

Репликационное покрытие – это микробиологическая техника, при которой одна или несколько вторичных чашек Петри, содержащих различные твердые (на основе агара) селективные среды для роста (лишенные питательных веществ или содержащие химические ингибиторы роста, такие как антибиотики), инокулируются теми же колониями микроорганизмов с первичной чашки (или мастер-пластинки), воспроизводя исходную пространственную структуру колоний. Техника включает в себя прижимание диска, покрытого бархатом, а затем отпечатывание вторичных чашек, перенося клетки из колоний с исходной чашки с помощью этого материала. Обычно реплицируют большое количество колоний (примерно 30–300) из-за сложности высева каждой колонии отдельно на отдельную чашку. Цель репликационного покрытия – сравнить мастер-пластинку и любые вторичные чашки, как правило, для выявления желаемого фенотипа. Например, если колония, присутствовавшая на первичной чашке (или мастер-пластинке), не появляется на вторичной чашке, это указывает на то, что колония была чувствительна к веществу на этой конкретной вторичной чашке. Распространенными фенотипами для скрининга являются ауксотрофия и устойчивость к антибиотикам. Репликационное покрытие особенно полезно для "отрицательного скрининга". Однако более корректно использовать термин "отрицательный скрининг", а не "отбор". Например, если необходимо отобрать колонии, чувствительные к ампициллину, первичную чашку можно реплицировать на вторичную чашку с агаром, содержащим ампициллин (Amp+). Чувствительные колонии на вторичной чашке погибнут, но колонии все равно можно будет идентифицировать на первичной чашке, поскольку у них сохранится та же пространственная структура, что и у колоний, устойчивых к ампициллину. Затем чувствительные колонии можно будет отобрать с первичной чашки. Часто последняя чашка будет неселективной. На рисунке неселективная чашка реплицируется после чашки с Amp+, чтобы подтвердить, что отсутствие роста на селективной чашке обусловлено самим отбором, а не проблемой с переносом клеток. Если на третьей (неселективной) чашке наблюдается рост, но не на второй, то селективный агент является причиной отсутствия роста. Если на неселективной чашке не наблюдается роста, нельзя сказать, были ли вообще перенесены жизнеспособные клетки, и нельзя делать никаких выводов о наличии или отсутствии роста на селективной среде. Это особенно полезно, если есть сомнения в возрасте или жизнеспособности клеток на исходной чашке. Увеличивая разнообразие вторичных чашек с различными селективными средами для роста, можно быстро проанализировать большое количество отдельных изолированных колоний на предмет такого же количества фенотипов, сколько и вторичных чашек. Разработка репликационного покрытия потребовала двух этапов. Первый этап заключался в определении проблемы: разработка метода для идентифицируемого дублирования колоний. Второй этап заключался в разработке способа надежной реализации первого этапа. Репликационное покрытие впервые было описано Эстер Ледерберг и Джошуа Ледерберг в 1952 году. На одной из питательных агаровых чашек будет наблюдаться устойчивость к антибиотикам. Ледерберг стремился использовать ткань, которую можно стерилизовать и которая имела бы вертикальный ворс, подобный двухмерному аналогу "проволочной щетки", традиционно используемой для переноса колоний. Бумага оказалась непригодной, поскольку "ее боковая капиллярность и сжатие колоний искажали и разрушали исходную структуру роста", а нейлоновый бархат был слишком дорогим, и его более жесткие волокна создавали проблемы, что привело к выбору и последующей стандартизации хлопкового бархата. Хотя впервые это было продемонстрировано с использованием бактерий, репликационное покрытие на основе бархата также стало стандартным методом в микробиологии эукариот, таких как дрожжи.