Расшифровка генетического кода: эксперименты Ниренберга и Маттеи и история открытия.

Введение

Эксперимент Ниренберга и Маттеи был научным экспериментом, проведенным в мае 1961 года Маршаллом В. Ниренбергом и его постдоком, Дж. Генрихом Маттеем, в Национальных институтах здоровья (NIH). В ходе эксперимента был расшифрован первый из 64 триплетных кодонов генетического кода, используя гомополимеры нуклеиновых кислот для синтеза определенных аминокислот. Для эксперимента был получен экстракт из бактериальных клеток, способный производить белок вне живых клеток. К экстракту добавили искусственную форму РНК, состоящую исключительно из нуклеотидов, содержащих урацил (полиуридиловая кислота или поли-U), что привело к образованию белка, полностью состоящего из аминокислоты фенилаланин. Этот эксперимент определил первый кодон генетического кода и показал, что РНК управляет производством определенных типов белков.

Предыстория

Открытия Фредерика Гриффита, усовершенствованные работами Освальда Эйвери, показали, что вещество, ответственное за создание наследственных изменений в бактериях, вызывающих заболевание (Streptococcus pneumoniae), не было ни белком, ни липидом, а дезоксирибонуклеиновой кислотой (ДНК). В 1944 году он и его коллеги Колин МакЛеод и Маклин МакКарти предположили, что ДНК отвечает за передачу генетической информации. Позднее Эрвин Чаргафф (1950) обнаружил, что состав ДНК различается у разных видов. Эти эксперименты подготовили почву для открытия структуры ДНК. В 1953 году, используя рентгеноструктурный анализ, проведенный Морисом Уилкинсом и Розалинд Франклин, Джеймс Уотсон и Фрэнсис Крик предложили, что ДНК имеет структуру двойной спирали. В 1960-х годах одной из главных загадок, которую ученым предстояло решить, было количество оснований в каждом кодовом слове, или кодоне, во время транскрипции. Ученые знали, что существует в общей сложности четыре основания (гуанин, цитозин, аденин и тимин). Они также знали, что существует 20 известных аминокислот. Джордж Гамов предположил, что генетический код состоит из трех нуклеотидов на аминокислоту. Он рассуждал, что поскольку существует 20 аминокислот и только четыре основания, кодирующие единицы не могут быть одинарными (4 комбинации) или парными (только 16 комбинаций). Скорее, он полагал, что триплеты (64 возможных комбинации) являются кодирующей единицей генетического кода. Однако он предположил, что триплеты перекрываются и не вырождены (позже это объяснил Крик в своей концепции «шатания»). Сеймур Бензер в конце 1950-х годов разработал метод анализа, основанный на мутациях фагов, который предоставил первую подробную линейно структурированную карту генетического региона. Крик считал, что он может использовать мутагенез и генетическую рекомбинацию фагов для дальнейшего уточнения природы генетического кода. В эксперименте Крика, Бреннера и др. с использованием этих фагов был подтвержден триплетный характер генетического кода. Они использовали мутации со сдвигом рамки считывания и процесс, называемый реверсиями, для добавления и удаления различного количества нуклеотидов. Когда к последовательности ДНК добавлялся или удалялся нуклеотидный триплет, кодируемый белок практически не изменялся. Таким образом, они пришли к выводу, что генетический код является триплетным, поскольку это не вызывало сдвига рамки считывания. Они правильно заключили, что код вырожден (несколько триплетов могут соответствовать одной аминокислоте) и что каждая нуклеотидная последовательность считывается с определенной точки начала.

Discoveries by Frederick Griffith and improved on by Oswald Avery discovered that the substance responsible for producing inheritable change in the disease causing bacteria (Streptococcus pneumoniae) was neither a protein nor a lipid, rather deoxyribonucleic acid (DNA). In 1944, he and his colleagues Colin MacLeod and Maclyn McCarty suggested that DNA was responsible for transferring genetic information. Later, Erwin Chargaff(1950) discovered that the makeup of DNA differs from one species to another. These experiments helped pave the way for the discovery of the structure of DNA. In 1953, with the help of Maurice Wilkins and Rosalind Franklin's X ray crystallography, James Watson and Francis Crick proposed DNA is structured as a double helix. In the 1960s, one main DNA mystery scientists needed to figure out was the number of bases found in each code word, or codon, during transcription. Scientists knew there was a total of four bases (guanine, cytosine, adenine, and thymine). They also knew that were 20 known amino acids. George Gamow suggested that the genetic code was made of three nucleotides per amino acid. He reasoned that because there are 20 amino acids and only four bases, the coding units could not be single (4 combinations) or pairs (only 16 combinations). Rather, he thought triplets (64 possible combinations) were the coding unit of the genetic code. However, he proposed that the triplets were overlapping and non degenerate (later explained by Crick in his Wobble concept). Seymour Benzer in the late 1950s had developed an assay using phage mutations which provided the first detailed linearly structured map of a genetic region. Crick felt he could use mutagenesis and genetic recombination phage to further delineate the nature of the genetic code. In the Crick, Brenner et al. experiment, using these phages, the triplet nature of the genetic code was confirmed. They used frameshift mutations and a process called reversions, to add and delete various numbers of nucleotides. When a nucleotide triplet was added or deleted to the DNA sequence the encoded protein was minimally affected. Thus, they concluded that the genetic code is a triplet code because it did not cause a frameshift in the reading frame. They correctly concluded that the code is degenerate (multiple triplets can correspond to a single amino acid) and that each nucleotide sequence is read from a specific starting point.

Экспериментальная работа

Чтобы разгадать эту биологическую тайну, Ниренбергу и Маттайи требовалась безклеточная система, способная собирать аминокислоты в белки. После работы Альфреда Тиссье и нескольких неудачных попыток они создали стабильную систему, разрушив клетки бактерии *E. coli* и высвободив содержимое цитоплазмы. Это позволило им синтезировать белок, но только при добавлении правильного типа РНК, что давало Ниренбергу и Маттайи возможность контролировать эксперимент. Они создавали синтетические молекулы РНК вне бактерии и вводили эту РНК в систему *E. coli*. В экспериментах использовались смеси со всеми 20 аминокислотами. Для каждого отдельного эксперимента 19 аминокислот были "холодными" (нерадиоактивными), а одна – "горячей" (радиоактивно меченной <sup>14</sup>C, чтобы впоследствии можно было обнаружить меченную аминокислоту). Они варьировали "горячую" аминокислоту в каждом раунде эксперимента, стремясь определить, какие аминокислоты будут включаться в белок после добавления определенного типа синтетической РНК. Ключевые первые эксперименты были проведены с поли-U (синтетическая РНК, состоящая только из оснований уридина, предоставленная Леоном Хеппелем и Максин Сингер). 27 мая 1961 года в 3 часа ночи Маттай использовал фенилаланин в качестве "горячей" аминокислоты. Через час контрольная пробирка (без поли-U) показала фоновый уровень в 70 отсчетов, в то время как пробирка с добавлением поли-U показала 38 000 отсчетов на миллиграмм белка, что продемонстрировало, что цепь повторяющихся оснований урацила образует белковая цепь, состоящую исключительно из повторяющейся аминокислоты фенилаланина. Хотя эксперимент не определил количество оснований в кодоне, он соответствовал тому, что триплетный кодон UUU кодирует фенилаланин. В аналогичных экспериментах с другими синтетическими РНК они обнаружили, что поли-C направляет синтез полипролина. Ниренберг рассказывает, что лаборатории Северо Очоа и Джеймса Уотсона ранее проводили подобные эксперименты с поли-A, но не смогли обнаружить синтез белка, поскольку полилизин (в отличие от большинства белков) растворим в трихлоруксусной кислоте. Кроме того, используя синтетические РНК, в которых случайным образом сочетались два основания в разных соотношениях, они получили белки, содержащие более одного типа аминокислот, из чего смогли сделать вывод о триплетной природе генетического кода и сузить возможные варианты кодонов для других аминокислот. Действительно, "за интерпретацию генетического кода и его функцию в синтезе белка" Маршалл Ниренберг, Роберт Холли и Хар Гобинд Хорана были удостоены Нобелевской премии по физиологии и медицине в 1968 году. Работая независимо друг от друга, доктор Холли (Университет Корнелла) обнаружил точную химическую структуру транспортной РНК, а доктор Хорана (Университет Висконсина в Мэдисоне) освоил синтез нуклеиновых кислот. Доктор Ниренберг показал – за исключением стоп-кодонов – что каждая комбинация триплета (то есть кодона), состоящего из четырех различных азотистых оснований, содержащихся в ДНК и РНК, производит определенную аминокислоту. Помимо Нобелевской премии, доктор Ниренберг получил премию по молекулярной биологии Национальной академии наук и премию по биологическим наукам Вашингтонской академии наук (1962), премию Пола Льюиса Американского химического общества (1963), медаль Министерства здравоохранения, образования и благосостояния, а также премию Харрисона Хоу Американского химического общества США (1864).

In order to decipher this biological mystery, Nirenberg and Matthaei needed a cell free system that would build amino acids into proteins. Following the work of Alfred Tissieres and after a few failed attempts, they created a stable system by rupturing E. coli bacteria cells and releasing the contents of the cytoplasm. This allowed them to synthesize protein, but only when the correct kind of RNA was added, allowing Nirenberg and Matthaei to control the experiment. They created synthetic RNA molecules outside the bacterium and introduced this RNA to the E. coli system. The experiments used mixtures with all 20 amino acids. For each individual experiment, 19 amino acids were "cold" (nonradioactive), and one was "hot" (radioactively tagged with 14C so they could detect the tagged amino acid later). They varied the "hot" amino acid in each round of the experiment, seeking to determine which amino acids would be incorporated into a protein following the addition of a particular type of synthetic RNA. The key first experiments were done with poly U (synthetic RNA composed only of uridine bases, provided by Leon Heppel and Maxine Singer). At 3 am on May 27, 1961, Matthaei used phenylalanine as the "hot" amino acid. After an hour, the control tube (no poly U) showed a background level of 70 counts, whereas the tube with poly U added showed 38,000 counts per milligram of protein. demonstrating that a chain of repeated uracil bases produced a protein chain made solely of the repeating amino acid phenylalanine. While the experiment did not determine the number of bases per codon, it was consistent with the triplet codon UUU coding for phenylalanine. In analogous experiments with other synthetic RNAs, they found that poly C directed synthesis of polyproline. Nirenberg recounts that the labs of Severo Ochoa and James Watson had earlier done similar experiments with poly A, but failed to detect protein synthesis because polylysine (unlike most proteins) is soluble in trichloroacetic acid. Further, using synthetic RNAs that randomly incorporated two bases at different ratios, they produced proteins containing more than one type of amino acid, from which they could deduce the triplet nature of the genetic code and narrow down the codon possibilities for other amino acids. Indeed, "for their interpretation of the genetic code and its function in protein synthesis," Marshall W. Nirenberg, Robert W. Holley, and Har Gobind Khorana were awarded the 1968 Nobel Prize in Physiology or Medicine. Working independently, Dr. Holley (Cornell University) had discovered the exact chemical structure of transfer RNA, and Dr. Khorana (University of Wisconsin in Madison) had mastered the synthesis of nucleic acids. Dr. Nirenberg showed excluding nonsense codons every combination of a triplet (i. e. a codon) composed of four different nitrogen containing bases found in DNA and in RNA produces a specific amino acid. In addition to the Nobel Prize, Dr. Nirenberg has received the Molecular Biology Award of the National Academy of Sciences and the Biological Science Award of the Washington Academy of Sciences (1962), the Paul Lewis Award of the American Chemical Society (1963), the Department of Health, Education, and Welfare Medal, along with the Harrison Howe Award of the American Chemical Society of USA, in America (1864).