Введение

Ген, который вызывает гибель клетки посредством апоптоза

В области генетики, ген самоубийства – это ген, который заставляет клетку уничтожать себя через процесс апоптоза (программируемой клеточной смерти). Активация гена самоубийства может приводить к гибели различными путями, но одним из важных клеточных "переключателей" для индуцирования апоптоза является белок p53. Стимуляция или введение (через генную терапию) генов самоубийства является потенциальным способом лечения рака или других пролиферативных заболеваний. Гены самоубийства лежат в основе стратегии повышения уязвимости или чувствительности раковых клеток к химиотерапии. Подход заключается в присоединении фрагментов генов, экспрессируемых в раковых клетках, к генам, кодирующим ферменты, отсутствующие у млекопитающих, способные превращать безвредные вещества в токсичные для опухоли. Большинство генов самоубийства опосредуют эту чувствительность, кодируя вирусные или бактериальные ферменты, которые преобразуют неактивный препарат в токсичные антиметаболиты, ингибирующие синтез нуклеиновых кислот. Гены самоубийства должны быть введены в клетки таким образом, чтобы обеспечить их поглощение и экспрессию максимально возможным количеством раковых клеток, при этом ограничивая их экспрессию в нормальных клетках. Генная терапия рака с использованием генов самоубийства требует, чтобы вектор обладал способностью различать целевые и нецелевые клетки, то есть раковые и нормальные клетки.

Апоптоз

Клеточная смерть может происходить главным образом посредством некроза или апоптоза. Некроз возникает, когда клетка повреждается внешним воздействием, таким как яд, физическая травма, инфекция или прекращение кровоснабжения. Смерть клеток от некроза – процесс довольно разрушительный. Она вызывает воспаление, которое может усугубить повреждение или вызвать дальнейшие травмы в организме. В то время как апоптоз вызывает деградацию клеточных компонентов без провоцирования воспалительной реакции. Многие клетки подвергаются запрограммированной клеточной смерти, или апоптозу, в период внутриутробного развития. Это форма клеточной смерти, при которой запрограммированная последовательность событий приводит к элиминации клеток без высвобождения вредных веществ в окружающую среду. Апоптоз играет ключевую роль в развитии и поддержании здоровья организма, удаляя старые, ненужные и нездоровые клетки. Человеческий организм, возможно, заменяет миллион клеток каждую секунду. Когда клетка вынуждена к самоуничтожению, в действие вступают белки, называемые каспазами. Они расщепляют клеточные компоненты, необходимые для выживания, и стимулируют выработку ферментов, известных как ДНКаза, которые разрушают ДНК в ядре клетки. Клетка сжимается и посылает сигналы бедствия, на которые реагируют макрофаги. Макрофаги удаляют сжавшиеся клетки, не оставляя следов, поэтому эти клетки не повреждают окружающие некротические клетки. Апоптоз также необходим для пренатального развития. Например, у эмбрионов пальцы рук и ног изначально соединены между собой тканями. Клетки этой соединительной ткани подвергаются апоптозу, формируя отдельные пальцы. В процессе развития мозга изначально создаются миллионы дополнительных нейронов. Клетки, которые не образуют синаптические связи, подвергаются апоптозу. Запрограммированная клеточная смерть также необходима для запуска процесса менструации. Это не означает, что апоптоз – идеальный процесс. Клетки, подвергающиеся апоптозу, умирают не из-за травмы, а в ответ на сигналы внутри организма. Когда клетки распознают вирусы и генетические мутации, они могут инициировать смерть, чтобы предотвратить распространение повреждений. Ученые пытаются выяснить, как можно модулировать апоптоз, чтобы контролировать, какие клетки живут, а какие подвергаются запрограммированной гибели. Противораковые препараты и лучевая терапия, например, действуют, вызывая апоптоз в пораженных клетках. Многие заболевания и расстройства связаны с жизнью и смертью клеток – повышенный апоптоз характерен для СПИДа, болезни Альцгеймера и болезни Паркинсона, в то время как снижение апоптоза может быть признаком системной красной волчанки или рака. Понимание того, как регулировать апоптоз, может стать первым шагом к лечению этих состояний. Слишком мало или слишком много апоптоза может играть роль во многих заболеваниях. Когда апоптоз функционирует неправильно, клетки, которые должны быть устранены, могут сохраняться и становиться бессмертными, например, при раке и лейкемии. Если же апоптоз работает слишком эффективно, он убивает слишком много клеток и наносит серьезный ущерб тканям. Это происходит при инсультах и нейродегенеративных заболеваниях, таких как болезнь Альцгеймера, болезнь Гентингтона и болезнь Паркинсона. Также известен как запрограммированная клеточная смерть и клеточное самоубийство.

Генная терапия для самоубийства рака

Конечная цель терапии рака – полное уничтожение всех раковых клеток, не повреждая здоровые клетки. Одной из наиболее перспективных терапевтических стратегий в этом отношении является генная терапия самоубийства рака (ГТСК), которая быстро развивается и открывает новые горизонты. Терапевтический успех в ГТСК в первую очередь зависит от точности доставки терапевтических трансгенов исключительно к раковым клеткам. Это достигается путем выявления и нацеливания на уникальные и/или сверхэкспрессированные биомаркеры, экспрессируемые на раковых клетках и раковых стволовых клетках. Специфичность терапевтического эффекта при раке дополнительно повышается за счет разработки ДНК-конструкций, в которых терапевтические гены находятся под контролем специфических для раковых клеток промоторов. Доставка суицидальных генов к раковым клеткам осуществляется с помощью вирусных и синтетических векторов, направляемых антителами и лигандами, специфичными для рака. Варианты доставки также включают в себя генетически модифицированные стволовые клетки с тропизмом к раку. Основные механизмы, вызывающие гибель раковых клеток, включают трансгенную экспрессию тимидинкиназ, цитозиндеаминаз, внутриклеточных антител, теломераз, каспаз, ДНКаз. Принимаются меры предосторожности для минимизации рисков, связанных с трансгенезом. Достижения в геномике и протеомике должны помочь в выявлении специфических для рака биомаркеров и метаболических путей для разработки новых стратегий, направленных на проведение клинических испытаний таргетной и персонализированной генной терапии рака. Вводя ген в злокачественную опухоль, можно добиться уменьшения ее размера и, возможно, полного исчезновения, при условии, что все клетки получили копию гена. Если ДНК-материал вируса получен из собственных здоровых клеток пациента, вирусу не требуется различать раковые и здоровые клетки. Кроме того, преимуществом является способность предотвращать метастазирование после гибели опухоли.

В качестве лечения рака

Одна из проблем лечения рака заключается в том, как уничтожить злокачественные опухоли, не повреждая здоровые клетки. Новый метод, демонстрирующий большие перспективы в решении этой задачи, использует ген самоубийства. Ген самоубийства – это ген, вызывающий гибель клетки посредством апоптоза. Генная терапия с использованием гена самоубийства включает доставку гена, кодирующего цитотоксический продукт, в опухолевые клетки. Этого можно достичь двумя подходами: косвенной генной терапией и прямой генной терапией. Косвенная генная терапия использует пролекарство, активируемое ферментом, в котором фермент превращает пролекарство в токсичное вещество, а ген, кодирующий этот фермент, доставляется в опухолевые клетки. Например, широко изучаемая стратегия основана на трансфекции тимидинкиназы вируса простого герпеса (HSV TK) в сочетании с введением ганцикловира (GSV), при которой HSV TK способствует преобразованию GCV в токсичное соединение, ингибирующее синтез ДНК и вызывающее гибель клеток. В то время как прямая генная терапия использует ген токсина или ген, способный корректировать мутировавшие проапоптотические гены, которые, в свою очередь, могут индуцировать гибель клеток посредством апоптоза. Например, наиболее исследованным иммунотоксином для терапии рака является дифтерийный токсин, поскольку он ингибирует синтез белка путем инактивации фактора удлинения 2 (EF2), что, в свою очередь, ингибирует трансляцию белка. Более того, p53 часто обнаруживается аномальным в опухолях человека, и исследования показывают, что восстановление функции p53 может вызвать апоптоз раковых клеток. Наконец, клеточные векторы используют стволовые клетки в качестве носителей генов самоубийства. В последние годы была запатентована генная терапия рака, основанная на использовании мезенхимальных стволовых клеток (МСК).

Эффект наблюдателя

Эффект наблюдателя (ЭН) – это явление, в результате которого возможно уничтожение нетрансфицированных опухолевых клеток, расположенных вблизи трансдуцированных клеток, при использовании генной терапии самоубийства. Поскольку добиться полной трансдукции всех опухолевых клеток крайне сложно, ЭН является критически важной характеристикой генной терапии самоубийства.

Ограничения

Предполагается, что для эффективности препарат должен проявлять высокую специфичность к раковым клеткам, однако исследования показали, что это удается редко. Более того, экспрессия гена-самоубийцы контролировалась опухолеспецифическими промоторами, такими как человеческая теломераза (hTERT), остеокальцин и карциноэмбриональный антиген, но в клинических испытаниях оказался только промотор hTERT. Это в основном связано с низкой транскрипционной активностью этих опухолеспецифических промоторов при экспрессии гена-самоубийцы. Дополнительно, плохая доступность к целевым клеткам является важным ограничением генной терапии с использованием гена-самоубийцы. Еще одним серьезным препятствием является частичная специфичность вектора к пораженным клеткам. Наконец, отсутствует достаточное количество специфических животных моделей для прогнозирования клинических результатов и других эффектов генной терапии с использованием гена-самоубийцы.

Биотехнология

Гены самоубийства часто используются в биотехнологии для облегчения молекулярного клонирования. Векторы содержат гены самоубийства для организма (например, E. coli). Задача проекта клонирования заключается в замене гена самоубийства на желаемый фрагмент. Отбор векторов, несущих желаемый фрагмент, упрощается, так как векторы, сохранившие ген самоубийства, вызывают гибель клеток.