Теломеры: структура и роль в защите хромосом.

Введение

Регион повторяющихся нуклеотидных последовательностей на хромосомах

Теломера (/tɛlɪər/, /’tiːlə/; ) – это область повторяющихся нуклеотидных последовательностей, ассоциированная со специализированными белками на концах линейных хромосом (см. Последовательности). Теломеры – широко распространенная генетическая особенность, наиболее часто встречающаяся у эукариот. В большинстве, если не во всех видах, обладающих ими, они защищают концевые участки хромосомной ДНК от прогрессирующей деградации и обеспечивают целостность линейных хромосом, предотвращая распознавание систем репарации ДНК концов ДНК как двухцепочечного разрыва.

Открытие

Существование особой структуры на концах хромосом независимо было предложено в 1938 году Германом Джозефом Мюллером, изучавшим плодовую муху Drosophila melanogaster, и в 1939 году Барбарой Макклинток, работавшей с кукурузой. Мюллер заметил, что концы облученных хромосом плодовой мухи не подвергались изменениям, таким как делеции или инверсии. Он предположил наличие защитного колпачка, который он назвал "теломерами", от греческих слов telos (конец) и meros (часть). В начале 1970-х годов советский теоретик Алексей Оловников первым указал на то, что хромосомы не могут полностью реплицировать свои концы; это известно как "проблема репликации концов". Развивая эту идею и учитывая предположение Леонарда Хейфлика об ограниченном количестве делений соматических клеток, Оловников предположил, что последовательности ДНК теряются при каждом реплицировании клетки, пока потери не достигнут критического уровня, после которого деление клеток прекращается. Согласно его теории маргинатомии, последовательности ДНК на концах теломер представлены тандемными повторами, которые создают буфер, определяющий количество делений, которым может подвергнуться определенный клеточный клон. Кроме того, было предсказано, что специализированная ДНК-полимераза (первоначально называемая тандемной ДНК-полимеразой) способна удлинять теломеры в бессмертных тканях, таких как зародышевые клетки, раковые клетки и стволовые клетки. Из этой гипотезы также следовало, что организмы с циркулярным геномом, такие как бактерии, не сталкиваются с проблемой репликации концов и, следовательно, не стареют. В 1975–1977 годах Элизабет Блэкберн, работая постдоком в Йельском университете под руководством Джозефа Галла, обнаружила необычную природу теломер, заключающуюся в их простых повторяющихся последовательностях ДНК, составляющих концы хромосом. Блэкберн, Кэрол Грейдер и Джек Шостак были удостоены Нобелевской премии по физиологии или медицине в 2009 году за открытие механизма защиты хромосом теломерами и ферментом теломеразой.

Проблема конечного воспроизведения

Во время репликации ДНК полимераза не может реплицировать последовательности, присутствующие на 3'-концах родительских цепей. Это является следствием её однонаправленного режима синтеза ДНК: она может присоединять новые нуклеотиды только к существующему 3'-концу (то есть синтез происходит в направлении 5' → 3') и, следовательно, для инициации репликации требуется праймер. На ведущей цепи (ориентированной 5' → 3' внутри репликативной вилки) ДНК-полимераза непрерывно реплицирует от точки инициации до конца цепи, после чего праймер (состоящий из РНК) вырезается и заменяется ДНК. Однако отстающая цепь ориентирована 3' → 5' относительно репликативной вилки, что делает непрерывную репликацию ДНК-полимеразой невозможной и требует прерывистой репликации, включающей повторный синтез праймеров в направлении 5' от точки инициации (см. репликацию отстающей цепи). Последний праймер, участвующий в репликации отстающей цепи, располагается вблизи 3'-конца матрицы (соответствующего потенциальному 5'-концу отстающей цепи). Изначально предполагалось, что последний праймер находится непосредственно на конце матрицы, поэтому после его удаления ДНК-полимераза, заменяющая праймеры ДНК (DNA Pol δ у эукариот), не смогла бы синтезировать "замещающую ДНК" с 5'-конца отстающей цепи, и нуклеотиды матрицы, ранее спаренные с последним праймером, не были бы реплицированы. Впоследствии возникли сомнения в том, что последний праймер отстающей цепи располагается точно на 3'-конце матрицы, и было показано, что он синтезируется на расстоянии около 70–100 нуклеотидов, что согласуется с данными о том, что ДНК в культивируемых клетках человека укорачивается на 50–100 пар оснований при каждом делении клетки. Если в этом процессе деградируют кодирующие последовательности, может быть потерян потенциально жизненно важный генетический код. Теломеры – это некодирующие, повторяющиеся последовательности, расположенные на концах линейных хромосом, служащие буфером для расположенных дальше кодирующих последовательностей. Они "закрывают" концевые последовательности и постепенно деградируют в процессе репликации ДНК. "Проблема репликации концов" является специфической для линейных хромосом, поскольку в кольцевых хромосомах нет концов, недоступных для ДНК-полимераз. Большинство прокариот, использующих кольцевые хромосомы, соответственно, не имеют теломер. Однако небольшая часть бактериальных хромосом (например, у Streptomyces, Agrobacterium и Borrelia) является линейной и имеет теломеры, которые значительно отличаются от теломер эукариот по структуре и функции. Известные структуры бактериальных теломер представлены в виде белков, связанных с концами линейных хромосом, или шпилек одноцепочечной ДНК на концах линейных хромосом.

During DNA replication, DNA polymerase cannot replicate the sequences present at the 3' ends of the parent strands. This is a consequence of its unidirectional mode of DNA synthesis: it can only attach new nucleotides to an existing 3' end (that is, synthesis progresses 5' 3') and thus it requires a primer to initiate replication. On the leading strand (oriented 5' 3' within the replication fork), DNA polymerase continuously replicates from the point of initiation all the way to the strand's end with the primer (made of RNA) then being excised and substituted by DNA. The lagging strand, however, is oriented 3' 5' with respect to the replication fork so continuous replication by DNA polymerase is impossible, which necessitates discontinuous replication involving the repeated synthesis of primers further 5' of the site of initiation (see lagging strand replication). The last primer to be involved in lagging strand replication sits near the 3' end of the template (corresponding to the potential 5' end of the lagging strand). Originally it was believed that the last primer would sit at the very end of the template, thus, once removed, the DNA polymerase that substitutes primers with DNA (DNA Pol δ in eukaryotes) would be unable to synthesize the "replacement DNA" from the 5' end of the lagging strand so that the template nucleotides previously paired to the last primer would not be replicated. It has since been questioned whether the last lagging strand primer is placed exactly at the 3' end of the template and it was demonstrated that it is rather synthesized at a distance of about 70–100 nucleotides which is consistent with the finding that DNA in cultured human cell is shortened by 50–100 base pairs per cell division. If coding sequences are degraded in this process, potentially vital genetic code would be lost. Telomeres are non coding, repetitive sequences located at the termini of linear chromosomes to act as buffers for those coding sequences further behind. They "cap" the end sequences and are progressively degraded in the process of DNA replication. The "end replication problem" is exclusive to linear chromosomes as circular chromosomes do not have ends lying without reach of DNA polymerases. Most prokaryotes, relying on circular chromosomes, accordingly do not possess telomeres. A small fraction of bacterial chromosomes (such as those in Streptomyces, Agrobacterium, and Borrelia), however, are linear and possess telomeres, which are very different from those of the eukaryotic chromosomes in structure and function. The known structures of bacterial telomeres take the form of proteins bound to the ends of linear chromosomes, or hairpin loops of single stranded DNA at the ends of the linear chromosomes.

Концы теломер и шелтерин

В самом 3'-конце теломера имеется 300-парный одноцепочечный участок, который может инвазировать двухцепочечную часть теломера, формируя структуру, известную как Т-петля. Эта петля аналогична узлу, стабилизирующему теломер и предотвращающему распознавание концов теломера как точек разрыва аппаратом репарации ДНК. В случае не гомологичного соединения концов на теломерных концах происходит слияние хромосом. Т-петля поддерживается несколькими белками, которые коллективно называются комплексом шелтерина. У человека комплекс шелтерина состоит из шести белков, идентифицированных как TRF1, TRF2, TIN2, POT1, TPP1 и RAP1. У многих видов последовательные повторы обогащены гуанином, например, TTAGGG у позвоночных, что позволяет формировать G-квадруплексы – особую конформацию ДНК, включающую не-Уотсон-Крик-спаривание оснований. Существуют различные подтипы в зависимости от вовлечения одно- или двухцепочечной ДНК, среди прочего. Имеются данные о том, что 3'-одноцепочечный участок у цилиат (обладающих теломерными повторами, сходными с таковыми у позвоночных) формирует такие G-квадруплексы, вмещающие его, а не Т-петлю. G-квадруплексы представляют собой препятствие для ферментов, таких как ДНК-полимеразы, и поэтому, предположительно, участвуют в регуляции репликации и транскрипции.

Теломераза

Многие организмы обладают рибонуклеопротеиновым ферментом, называемым теломеразой, который выполняет функцию добавления повторяющихся нуклеотидных последовательностей к концам ДНК. Теломераза "восстанавливает" теломерный "колпачок" и не требует АТФ. В большинстве многоклеточных эукариотических организмов теломераза активна только в зародышевых клетках, некоторых типах стволовых клеток, таких как эмбриональные стволовые клетки, и определенных типах лейкоцитов. Теломераза может быть реактивирована, а теломеры возвращены в эмбриональное состояние посредством переноса ядра соматической клетки. Постепенное укорочение теломер при каждом делении в соматических (телесных) клетках может играть роль в старении и предотвращении рака. Это происходит потому, что теломеры действуют как своего рода предохранитель с задержкой, в конечном итоге истощаясь после определенного числа делений клеток и приводя к постепенной потере жизненно важной генетической информации из хромосом клетки при последующих делениях.

Длина

Длина теломер значительно варьируется у разных видов, от примерно 300 пар оснований у дрожжей до многих килобаз у человека, и обычно состоит из повторяющихся последовательностей, богатых гуанином, длиной от шести до восьми пар оснований. Теломеры эукариотических клеток обычно заканчиваются 3'-одноцепочечным концом ДНК длиной от 75 до 300 оснований, что необходимо для поддержания и защиты теломер. Было идентифицировано множество белков, связывающихся с одно- и двухцепочечной теломерной ДНК. Эти белки участвуют как в поддержании, так и в защите теломер. Теломеры формируют крупные петлевые структуры, называемые теломерными петлями или Т-петлями. В этих структурах одноцепочечная ДНК закручивается в длинный круг, стабилизированный белками, связывающими теломеры. На самом конце Т-петли одноцепочечная теломерная ДНК удерживается на участке двухцепочечной ДНК, при этом двойная спираль ДНК разрывается, а одноцепочечная ДНК комплементарно спаривается с одной из двух цепей. Эта трехцепочечная структура называется петлей вытеснения или D-петлей.

Окислительное повреждение

Помимо проблемы концевой репликации, исследования in vitro показали, что теломеры накапливают повреждения из-за окислительного стресса, и что повреждение ДНК, опосредованное окислительным стрессом, оказывает существенное влияние на укорочение теломер in vivo. Существует множество путей, посредством которых окислительный стресс, вызванный реактивными формами кислорода (ROS), может приводить к повреждению ДНК; однако до сих пор неясно, обусловлена ли повышенная частота повреждений в теломерах их внутренней восприимчивостью или сниженной активностью систем репарации ДНК в этих областях. Несмотря на широкое согласие с полученными данными, были выявлены существенные недостатки в методиках измерения и отбора образцов; например, считается, что зависимость окислительного повреждения теломер от вида и ткани недостаточно учитывается. Популяционные исследования указывают на взаимодействие между потреблением антиоксидантов и длиной теломер. В рамках проекта исследования рака молочной железы на Лонг-Айленде (LIBCSP) авторы обнаружили умеренное увеличение риска рака молочной железы у женщин с самыми короткими теломерами и низким потреблением бета-каротина, витамина С или Е. Эти результаты позволяют предположить, что риск развития рака, связанный с укорочением теломер, может взаимодействовать с другими механизмами повреждения ДНК, в частности, с окислительным стрессом.

Связь со старением

Хотя теломеры укорачиваются на протяжении жизни организма, именно скорость укорочения теломер, а не их длина, связана с продолжительностью жизни вида. Укорочение теломер связано со старением, смертностью и болезнями, связанными со старением, у экспериментальных животных. Несмотря на то, что многие факторы, такие как курение, питание и физические упражнения, могут влиять на продолжительность жизни человека, по мере приближения к предельному возрасту, более длинные теломеры могут быть связаны с продолжительностью жизни.

Потенциальное воздействие психологического стресса

Мета-анализы показали, что повышенный уровень воспринимаемого психологического стресса связан с небольшим сокращением длины теломер, однако эти связи ослабевают и становятся статистически незначимыми при учёте предвзятости публикаций. Литература, посвящённая теломерам как интегративным биомаркерам воздействия стресса и неблагоприятных факторов, в основном состоит из поперечных и корреляционных исследований, что затрудняет причинно-следственную интерпретацию результатов. Обзор 2020 года показал, что связь между психосоциальным стрессом и длиной теломер наиболее выражена в случае стресса, пережитого в утробе матери или в раннем детстве.

Удлинение

Феномен ограниченного клеточного деления был впервые обнаружен Леонардом Хейфликом и теперь известен как предел Хейфлика. Впоследствии группа ученых, организованная Майклом Д. Уэстом, основателем компании Geron, в корпорации Geron, сделала значительные открытия, связавшие укорочение теломер с пределом Хейфлика. Клонирование каталитического компонента теломеразы позволило провести эксперименты для проверки, способна ли экспрессия теломеразы на уровне, достаточном для предотвращения укорочения теломер, к бессмертизации человеческих клеток. В публикации 1998 года в журнале Science было продемонстрировано, что теломераза способна продлевать жизнь клеток, и теперь широко признано, что она способна к бессмертизации человеческих соматических клеток. Два исследования, проведенных на долгоживущих морских птицах, показывают, что роль теломер еще далеко не полностью понятна. В 2003 году ученые обнаружили, что теломеры буревестника Лича (Oceanodroma leucorhoa) кажутся удлиняющимися с хронологическим возрастом, что стало первым зафиксированным случаем подобного поведения теломер. В одном исследовании сообщалось, что длина теломер у разных видов млекопитающих коррелирует с продолжительностью жизни скорее обратно пропорционально, чем прямо пропорционально, и было заключено, что вклад длины теломер в продолжительность жизни остается предметом споров. Существует мало доказательств того, что у людей длина теломер является значимым биомаркером нормального старения в отношении важных когнитивных и физических функций.

Измерение

В настоящее время для оценки средней длины теломер в эукариотических клетках используется несколько методов. Один из них – саузерн-блоттинг с использованием фрагментов терминального ограничения (TRF). Существует веб-анализатор длины теломер (WALTER) – программное обеспечение для обработки изображений TRF. Анализ ПЦР в реальном времени для определения длины теломер включает в себя определение соотношения теломер к однокопийному гену (T/S), которое, как было показано, пропорционально средней длине теломер в клетке. Также разработаны инструменты для оценки длины теломер на основе данных секвенирования целого генома (WGS). К ним относятся TelSeq, Telomerecat и telomereHunter. Оценка длины на основе WGS обычно выполняется путем дифференциации последовательностей, соответствующих теломерам, и последующего вывода длины теломер, которая привела к получению такого количества последовательностей. Показано, что эти методы коррелируют с ранее существовавшими методами оценки, такими как ПЦР и TRF. Flow-FISH используется для количественной оценки длины теломер в лейкоцитах человека. Полуавтоматический метод измерения средней длины теломер с помощью Flow-FISH был опубликован в журнале Nature Protocols в 2006 году. Несмотря на то, что многие компании предлагают услуги по измерению длины теломер, практическая ценность этих измерений для широкого клинического или личного использования вызывает вопросы. Лауреат Нобелевской премии Элизабет Блэкберн, являвшаяся соучредителем одной из этих компаний, продвигала клиническую значимость измерения длины теломер.

В дикой природе

В течение последних двух десятилетий экоэволюционные исследования изучали влияние характеристик жизненного цикла и условий окружающей среды на теломеры диких животных. Большинство этих исследований проводились на эндотермах, то есть птицах и млекопитающих. Они предоставили доказательства наследования длины теломер; однако оценки наследуемости значительно варьируют как внутри, так и между видами. У позвоночных возраст и длина теломер часто находятся в отрицательной корреляции, но характер этого снижения варьируется у разных таксонов и зависит от метода оценки длины теломер. В то же время, имеющиеся данные не выявляют половых различий в длине теломер у позвоночных. Филогенетические связи и характеристики жизненного цикла, такие как размер тела или темп жизни, также могут влиять на динамику теломер. Например, это было описано у различных видов птиц и млекопитающих. Метаанализ 2019 года подтвердил, что воздействие стрессовых факторов (например, инфекции патогенами, конкуренции, репродуктивных усилий и высокой активности) связано с укорочением теломер у различных таксонов животных. Исследования эктотермов и других не млекопитающих организмов показывают, что не существует единой универсальной модели эрозии теломер; скорее, наблюдается широкая вариативность в соответствующих динамических процессах у метазоев, и даже внутри более мелких таксономических групп эти закономерности оказываются разнообразными.