Теломераза: восстановление теломер и роль в делении клеток.

Введение

Теломерный восстанавливающий белок активен в наиболее быстро делящихся клетках.

Теломераза, также называемая терминальной трансферазой, – это рибонуклеопротеин, который добавляет видоспецифическую последовательность повторов теломер к 3'-концу теломер. Теломера – это область повторяющихся последовательностей на каждом конце хромосом у большинства эукариот. Теломеры защищают концы хромосом от повреждений ДНК и слияния с соседними хромосомами. У плодовой мушки Drosophila melanogaster теломераза отсутствует, но вместо этого для поддержания теломер используются ретротранспозоны. Теломераза является ферментом обратной транскриптазы, который содержит собственную молекулу РНК (например, с последовательностью 3′ CCCAAUCCC 5′ у Trypanosoma brucei), используемую в качестве матрицы при удлинении теломер. Теломераза активна в гаметах и большинстве раковых клеток, но обычно отсутствует в большинстве соматических клеток.

История

Существование компенсаторного механизма укорочения теломер впервые было обнаружено советским биологом Алексеем Оловниковым в 1973 году, который также предложил теорию теломерного старения и установил связь теломер с раком и, возможно, некоторыми нейродегенеративными заболеваниями. Вместе с Джеком В. Шостаком, Грейдер и Блэкберн были удостоены Нобелевской премии 2009 года по физиологии или медицине за это открытие. Впоследствии структура теломеразы, полученная методом криоэлектронной микроскопии (криоЭМ), впервые была определена для *T. thermophila*, а через несколько лет – для человека. Роль теломер и теломеразы в старении клеток и развитии рака была установлена учеными из биотехнологической компании Geron путем клонирования РНК и каталитических компонентов человеческой теломеразы, а также разработки анализа активности теломеразы на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР), известного как TRAP-анализ, который позволяет оценить активность теломеразы при различных типах рака. Структуры человеческой и тетрахименной теломераз, полученные методом электронной микроскопии с использованием негативного контрастирования (ЭМ), были охарактеризованы в 2013 году. Два года спустя была определена первая структура голофермента теломеразы (*Tetrahymena*), полученная методом криоэлектронной микроскопии (криоЭМ). В 2018 году ученые из Калифорнийского университета в Беркли определили структуру человеческой теломеразы с помощью криоЭМ.

Структура теломеразы человека

Молекулярный состав человеческого комплекса теломеразы был определен Скотом Коэном и его командой в Институте медицинских исследований детей (Сидней, Австралия) и состоит из двух молекул каждого из следующих компонентов: обратной транскриптазы теломеразы человека (TERT), компонента РНК теломеразы (TR или TERC) и дискерина (DKC1). Гены субъединиц теломеразы, включая TERT, TERC, DKC1 и TEP1, расположены на разных хромосомах. Ген TERT человека (hTERT) транслируется в белок, состоящий из 1132 аминокислот. Полипептид TERT формирует комплекс с (и переносит) TERC – некодирующей РНК длиной 451 нуклеотид. TERT имеет структуру, напоминающую "перчатку", что позволяет ему оборачиваться вокруг хромосомы для добавления одноцепочечных повторов теломер. TERT является обратной транскриптазой, классом ферментов, которые синтезируют одноцепочечную ДНК, используя одноцепочечную РНК в качестве матрицы. Белок состоит из четырех консервативных доменов (домен связывания РНК (ДВРК), "пальцы", "ладонь" и "большой палец"), организованных в кольцевую конфигурацию, напоминающую "правую руку", и имеющих общие черты с ретровирусными обратными транскриптазами, вирусными РНК-репликазами и ДНК-полимеразами семейства B бактериофагов. Белки TERT многих эукариот были секвенированы.

Механизм

Белок шелтерина TPP1 необходим и достаточен для рекрутирования фермента теломеразы к теломерам и является единственным белком шелтерина, находящимся в прямом контакте с теломеразой. Используя TERC, TERT может добавлять повторяющуюся последовательность из шести нуклеотидов, 5' TTAGGG (у позвоночных; последовательность различается у других организмов) к 3'-концу хромосом. Эти повторы TTAGGG (вместе с различными белками, связывающимися с ними) называются теломерами. Область-шаблон TERC имеет последовательность 3' CAAUCCCAAUC 5'. Теломераза может связать первые несколько нуклеотидов шаблона с последней последовательностью теломера на хромосоме, добавить новую последовательность повтора теломера (5' GGTTAG 3'), отсоединиться, выровнять новый 3'-конец теломера относительно шаблона и повторить процесс. Теломераза предотвращает укорочение теломер.

Старение

Теломераза восстанавливает короткие участки ДНК, известные как теломеры, которые в противном случае укорачиваются после многократного деления клетки посредством митоза. В нормальных условиях, при отсутствии теломеразы, при рекурсивном делении клетки ее потомство в определенный момент достигает предела Хейфлика, который, по оценкам, составляет от 50 до 70 клеточных делений. На этом пределе клетки становятся стареющими, и клеточное деление прекращается. Теломераза позволяет каждому потомку восполнять утраченный участок ДНК, позволяя клеточной линии делиться, не достигая этого предела. Такой же неограниченный рост характерен для раковых новообразований. Эмбриональные стволовые клетки экспрессируют теломеразу, что позволяет им многократно делиться и формировать организм. У взрослых теломераза высоко экспрессируется только в клетках, которым необходимо регулярно делиться, особенно в мужских сперматозоидах, но также в эпидермальных клетках, активированных T-клетках и B-клеточных лимфоцитах, а также в некоторых взрослых стволовых клетках, однако в большинстве случаев соматические клетки не экспрессируют теломеразу. Сравнительное биологическое исследование теломер млекопитающих показало, что длина теломер у некоторых видов млекопитающих коррелирует обратно, а не напрямую, с продолжительностью жизни, и сделало вывод, что вклад длины теломер в продолжительность жизни остается невыясненным. Укорочение теломер не происходит с возрастом в некоторых постмитотических тканях, например, в мозге крысы. У человека длина теломер скелетных мышц остается стабильной в возрасте от 23 до 74 лет. В скелетных мышцах бабуинов, состоящих из полностью дифференцированных постмитотических клеток, менее 3% мионуклеусов содержат поврежденные теломеры, и этот процент не увеличивается с возрастом. Таким образом, укорочение теломер, по-видимому, не является основным фактором старения дифференцированных клеток мозга или скелетных мышц. В печени человека холангиоциты и гепатоциты не демонстрируют возрастного укорочения теломер. Другое исследование показало, что у людей длина теломер не является значимым биомаркером нормального старения в отношении важных когнитивных и физических способностей. Некоторые эксперименты поставили под сомнение возможность использования теломеразы в качестве терапии против старения, в частности, тот факт, что мыши с повышенным уровнем теломеразы имеют более высокую заболеваемость раком и, следовательно, не живут дольше. С другой стороны, одно исследование показало, что активация теломеразы у мышей, устойчивых к раку, путем сверхэкспрессии ее каталитического субъединения продлевает продолжительность жизни. Исследование показало, что долгожители унаследовали гиперактивную версию теломеразы.

Telomerase restores short bits of DNA known as telomeres, which are otherwise shortened after repeated division of a cell via mitosis. In normal circumstances, where telomerase is absent, if a cell divides recursively, at some point the progeny reach their Hayflick limit, which is believed to be between 50 and 70 cell divisions. At the limit the cells become senescent and cell division stops. Telomerase allows each offspring to replace the lost bit of DNA, allowing the cell line to divide without ever reaching the limit. This same unbounded growth is a feature of cancerous growth. Embryonic stem cells express telomerase, which allows them to divide repeatedly and form the individual. In adults, telomerase is highly expressed only in cells that need to divide regularly, especially in male sperm cells, but also in epidermal cells, in activated T cell and B cell lymphocytes, as well as in certain adult stem cells, but in the great majority of cases somatic cells do not express telomerase. A comparative biology study of mammalian telomeres indicated that telomere length of some mammalian species correlates inversely, rather than directly, with lifespan, and concluded that the contribution of telomere length to lifespan is unresolved. Telomere shortening does not occur with age in some postmitotic tissues, such as in the rat brain. In humans, skeletal muscle telomere lengths remain stable from ages 23 –74. In baboon skeletal muscle, which consists of fully differentiated postmitotic cells, less than 3% of myonuclei contain damaged telomeres and this percentage does not increase with age. Thus, telomere shortening does not appear to be a major factor in the aging of the differentiated cells of brain or skeletal muscle. In human liver, cholangiocytes and hepatocytes show no age related telomere shortening. Another study found little evidence that, in humans, telomere length is a significant biomarker of normal aging with respect to important cognitive and physical abilities. Some experiments have raised questions on whether telomerase can be used as an anti aging therapy, namely, the fact that mice with elevated levels of telomerase have higher cancer incidence and hence do not live longer. On the other hand, one study showed that activating telomerase in cancer resistant mice by overexpressing its catalytic subunit extended lifespan. A study found that long lived subjects inherited a hyperactive version of telomerase.

Преждевременное старение

Синдромы преждевременного старения, включая синдром Вернера, прогерию, атаксию-телеангиэктазию, синдром, подобный атаксии-телеангиэктазии, синдром Блума, анемию Фанкони и синдром Ниймегенской хромосомной нестабильности, связаны с укорочением теломер. Однако гены, мутации в которых вызывают эти заболевания, участвуют в репарации повреждений ДНК, и повышение уровня повреждений ДНК само по себе может быть фактором преждевременного старения (см. теорию повреждения ДНК в контексте старения). Дополнительная роль в поддержании длины теломер активно изучается.

Рак

In vitro, когда клетки приближаются к пределу Хейфлика, время достижения старения может быть увеличено путем инактивации опухолевых супрессоров p53 и белка ретинобластомы (pRb). Клетки, подвергшиеся таким изменениям, в конечном итоге переживают событие, называемое "кризисом", когда большинство клеток в культуре погибает. Иногда клетка не прекращает делиться после достижения кризиса. В типичной ситуации теломеры укорачиваются, а целостность хромосом снижается с каждым последующим делением клетки. Открытые концы хромосом интерпретируются как двухнитевые разрывы (DSB) в ДНК; такое повреждение обычно восстанавливается путем соединения разорванных концов. Когда клетка делает это из-за укорочения теломер, концы разных хромосом могут соединяться друг с другом. Это решает проблему отсутствия теломер, но во время анафазы деления клетки слитые хромосомы случайным образом разрываются, вызывая множество мутаций и хромосомных аномалий. По мере продолжения этого процесса геном клетки становится нестабильным. В конечном итоге либо наносится фатальное повреждение хромосомам клетки (приводящее к ее гибели посредством апоптоза), либо происходит дополнительная мутация, активирующая теломеразу. Именно поэтому они могут образовывать опухоли. Хорошим примером бессмертных раковых клеток являются клетки HeLa, которые используются в лабораториях в качестве модельной клеточной линии с 1951 года. Хотя этот метод моделирования рака человека в клеточной культуре эффективен и используется учеными на протяжении многих лет, он также очень неточен. Точные изменения, позволяющие формировать опухолегенные клоны в описанном выше эксперименте, неясны. Ученые рассмотрели этот вопрос, последовательно вводя множество мутаций, присутствующих в различных типах рака человека. Это привело к выявлению комбинаций мутаций, формирующих опухолегенные клетки в различных типах клеток. Хотя комбинация варьируется в зависимости от типа клеток, во всех случаях требуются следующие изменения: активация TERT, потеря функции пути p53, потеря функции пути pRb, активация протоонкогенов Ras или myc и аберрация протеинфосфатазы PP2A. Другими словами, клетка имеет активированную теломеразу, устраняющую процесс гибели из-за нестабильности или потери хромосом, отсутствие путей индукции апоптоза и продолжающуюся активацию митоза. Эта модель рака в клеточной культуре точно описывает роль теломеразы в реальных опухолях человека. Активация теломеразы наблюдается примерно в 90% всех опухолей человека, что позволяет предположить, что бессмертие, обеспечиваемое теломеразой, играет ключевую роль в развитии рака. Из опухолей без активации TERT большинство используют отдельный путь для поддержания длины теломер, называемый альтернативным удлинением теломер (ALT). Точный механизм поддержания теломер в ALT-пути неясен, но, вероятно, включает в себя множественные события рекомбинации на уровне теломер. Элизабет Блэкберн и др. выявили повышение регуляции 70 генов, известных или подозреваемых в росте и распространении рака, а также активацию гликолиза, которая позволяет раковым клеткам быстро использовать сахар для обеспечения запрограммированной скорости роста (примерно как скорость роста плода). Подходы к контролю теломеразы и теломер для терапии рака включают генную терапию, иммунотерапию, ингибиторы малых молекул и сигнальных путей. Активность теломеразы необходима для сохранения многих типов рака и неактивна в соматических клетках, что создает возможность избирательного подавления роста раковых клеток с минимальными побочными эффектами посредством ингибирования теломеразы. Если препарат может ингибировать теломеразу в раковых клетках, теломеры последующих поколений будут прогрессивно укорачиваться, ограничивая рост опухоли. Теломераза является хорошим биомаркером для выявления рака, поскольку большинство раковых клеток человека экспрессируют высокие ее уровни. Активность теломеразы может быть идентифицирована по ее каталитическому белковому домену (hTERT). является лимитирующей стадией активности теломеразы. Она связана со многими типами рака. Различные раковые клетки и фибробласты, трансформированные hTERT cDNA, обладают высокой активностью теломеразы, в то время как соматические клетки – нет. Клетки, положительные по hTERT, имеют положительные ядерные сигналы. Ткань эпителиальных стволовых клеток и ее ранние дочерние клетки являются единственными нераковыми клетками, в которых можно обнаружить hTERT. Поскольку экспрессия hTERT зависит только от количества опухолевых клеток в образце, количество hTERT указывает на тяжесть рака. Экспрессия hTERT также может быть использована для различения доброкачественных и злокачественных опухолей. Злокачественные опухоли имеют более высокую экспрессию hTERT, чем доброкачественные. Это было подтверждено количественной ПЦР в реальном времени с обратной транскрипцией (RT-PCR), определяющей экспрессию hTERT в различных образцах опухолей. Отсутствие теломеразы не влияет на рост клеток, пока теломеры не станут достаточно короткими, чтобы вызвать гибель клеток или остановку роста. Однако одного лишь ингибирования теломеразы недостаточно для уничтожения крупных опухолей. Его необходимо сочетать с хирургическим вмешательством, лучевой терапией, химиотерапией или иммунотерапией. Теломераза-активатор TA 65 доступен в продаже и, как утверждается, замедляет старение и облегчает определенные заболевания. Эта формула содержит молекулу под названием циклоастрагенол, полученную из бобового растения Astragalus membranaceus. Было обнаружено, что несколько других соединений увеличивают активность теломеразы: экстракт Centella asiatica в 8,8 раза, олеановая кислота в 5,9 раза, экстракт астрагала в 4,3 раза, TA 65 в 2,2 раза и маслиновая кислота в 2 раза.

In vitro, when cells approach the Hayflick limit, the time to senescence can be extended by inactivating the tumor suppressor proteins p53 and Retinoblastoma protein (pRb). Cells that have been so altered eventually undergo an event termed a "crisis" when the majority of the cells in the culture die. Sometimes, a cell does not stop dividing once it reaches a crisis. In a typical situation, the telomeres are shortened and chromosomal integrity declines with every subsequent cell division. Exposed chromosome ends are interpreted as double stranded breaks (DSB) in DNA; such damage is usually repaired by reattaching the broken ends together. When the cell does this due to telomere shortening, the ends of different chromosomes can be attached to each other. This solves the problem of lacking telomeres, but during cell division anaphase, the fused chromosomes are randomly ripped apart, causing many mutations and chromosomal abnormalities. As this process continues, the cell's genome becomes unstable. Eventually, either fatal damage is done to the cell's chromosomes (killing it via apoptosis), or an additional mutation that activates telomerase occurs. is why they can form tumors. A good example of immortal cancer cells is HeLa cells, which have been used in laboratories as a model cell line since 1951. While this method of modelling human cancer in cell culture is effective and has been used for many years by scientists, it is also very imprecise. The exact changes that allow for the formation of the tumorigenic clones in the above described experiment are not clear. Scientists addressed this question by the serial introduction of multiple mutations present in a variety of human cancers. This has led to the identification of mutation combinations that form tumorigenic cells in a variety of cell types. While the combination varies by cell type, the following alterations are required in all cases: TERT activation, loss of p53 pathway function, loss of pRb pathway function, activation of the Ras or myc proto oncogenes, and aberration of the PP2A protein phosphatase. That is to say, the cell has an activated telomerase, eliminating the process of death by chromosome instability or loss, absence of apoptosis induction pathways, and continued mitosis activation. This model of cancer in cell culture accurately describes the role of telomerase in actual human tumors. Telomerase activation has been observed in ~90% of all human tumors, suggesting that the immortality conferred by telomerase plays a key role in cancer development. Of the tumors without TERT activation, most employ a separate pathway to maintain telomere length termed Alternative Lengthening of Telomeres (ALT). The exact mechanism behind telomere maintenance in the ALT pathway is unclear, but likely involves multiple recombination events at the telomere. Elizabeth Blackburn et al., identified the upregulation of 70 genes known or suspected in cancer growth and spread through the body, and the activation of glycolysis, which enables cancer cells to rapidly use sugar to facilitate their programmed growth rate (roughly the growth rate of a fetus). Approaches to controlling telomerase and telomeres for cancer therapy include gene therapy, immunotherapy, small molecule and signal pathway inhibitors. Telomerase activity is necessary to preserve many cancer types and is inactive in somatic cells, creating the possibility that telomerase inhibition could selectively repress cancer cell growth with minimal side effects. If a drug can inhibit telomerase in cancer cells, the telomeres of successive generations will progressively shorten, limiting tumor growth. Telomerase is a good biomarker for cancer detection because most human cancer cells express high levels of it. Telomerase activity can be identified by its catalytic protein domain (hTERT). is the rate limiting step in telomerase activity. It is associated with many cancer types. Various cancer cells and fibroblasts transformed with hTERT cDNA have high telomerase activity, while somatic cells do not. Cells testing positive for hTERT have positive nuclear signals. Epithelial stem cell tissue and its early daughter cells are the only noncancerous cells in which hTERT can be detected. Since hTERT expression is dependent only on the number of tumor cells within a sample, the amount of hTERT indicates the severity of cancer. The expression of hTERT can also be used to distinguish benign tumors from malignant tumors. Malignant tumors have higher hTERT expression than benign tumors. Real time reverse transcription polymerase chain reaction (RT PCR) quantifying hTERT expression in various tumor samples verified this varying expression. The lack of telomerase does not affect cell growth until the telomeres are short enough to cause cells to "die or undergo growth arrest". However, inhibiting telomerase alone is not enough to destroy large tumors. It must be combined with surgery, radiation, chemotherapy or immunotherapy. A telomerase activator TA 65 is commercially available and is claimed to delay aging and to provide relief from certain disease conditions. This formulation contains a molecule called cycloastragenol derived from a legume Astragalus membranaceus. Several other compounds have been found to increase telomerase activity: Centella asiatica extract 8.8 fold, oleanolic acid 5.9 fold, astragalus extract 4.3 fold, TA 65 2.2 fold, and maslinic acid 2 fold.

Иммунотерапия

Иммунотерапия успешно лечит некоторые виды рака, такие как меланома. Этот метод лечения включает в себя манипулирование иммунной системой человека для уничтожения раковых клеток. У человека есть два основных типа лимфоцитов, распознающих антигены: CD8+ цитотоксические Т-лимфоциты (CTL) и CD4+ Т-хелперы, которые способны уничтожать клетки. Антигенные рецепторы на CTL могут связываться с пептидной цепью из 9-10 аминокислот, представленной основным комплексом гистосовместимости (MHC), как показано на рисунке 4. HTERT является потенциальной целевой антигенной молекулой. Иммунотаргетинг должен вызывать относительно небольшое количество побочных эффектов, поскольку экспрессия hTERT связана исключительно с теломеразой и не является необходимой для большинства соматических клеток. GV1001 использует этот механизм. Большинство вредных для организма эффектов, связанных с теломеразой при раке, зависят от целостности РНК-матрицы. Раковые стволовые клетки, использующие альтернативные методы поддержания теломер, также погибают при блокировке или повреждении РНК-матрицы теломеразы.

Вакцины против теломеразы

Были разработаны две вакцины против теломеразы: GRNVAC1 и GV1001. GRNVAC1 выделяет дендритные клетки и РНК, кодирующую белок теломеразы, и возвращает их пациенту для стимуляции выработки цитотоксических Т-клеток, уничтожающих клетки, в которых активна теломераза. GV1001 представляет собой пептид, полученный из активного центра hTERT, который распознается иммунной системой и вызывает уничтожение клеток, в которых активна теломераза.

Целевой апоптоз

Другой независимый подход заключается в использовании олигоаденилированных антителомеразных антисенсовых олигонуклеотидов и рибозимов для воздействия на РНК теломеразы, снижая диссоциацию и вызывая апоптоз (рисунок 5). Быстрая индукция апоптоза посредством антисмыслового связывания может быть хорошей альтернативой более медленному укорочению теломер. Лечение как siRNA, так и облучением привело к большему уменьшению размера опухоли у мышей, чем лечение только облучением, что позволяет предположить, что воздействие на теломеразу может стать способом повышения эффективности облучения при лечении опухолей, устойчивых к облучению.

Сердечные заболевания, диабет и качество жизни

Блэкберн также обнаружила, что у матерей, ухаживающих за очень больными детьми, теломеры короче, когда они сообщают о максимальном уровне эмоционального стресса, и что теломераза была активна в местах блокировок в ткани коронарных артерий, что, возможно, ускоряет развитие сердечных приступов. В 2009 году было показано, что количество активности теломеразы значительно возрастает после психологического стресса. В исследуемой группе пациентов активность теломеразы в периферических мононуклеарных клетках крови увеличилась на 18% через час после прекращения стресса. Исследование 2010 года показало, что у участников после трехмесячного медитативного ретрита активность теломеразы была "значительно выше", чем у контрольной группы. Дефицит теломеразы связан с сахарным диабетом и нарушением секреции инсулина у мышей из-за потери инсулин-продуцирующих клеток поджелудочной железы.

Редкие заболевания человека

Мутации в гене TERT были связаны с предрасположенностью пациентов к апластической анемии, заболеванию, при котором костный мозг перестает производить клетки крови, в 2005 году. Синдром «кошачьего крика» (CdCS) – это сложное заболевание, связанное с потерей дистального участка короткого плеча 5-й хромосомы. Ген TERT расположен в этой удаленной области, и потеря одной копии TERT была предложена в качестве причины или способствующего фактора этого заболевания. Врожденный дискератоз (DC) – это заболевание костного мозга, которое может быть вызвано некоторыми мутациями в субъединицах теломеразы. В случаях DC примерно 35% случаев обусловлены X-сцепленным рецессивным наследованием в локусе DKC1, а 5% случаев – аутосомно-доминантным наследованием в локусах TERT и TERC. У пациентов с DC наблюдается тяжелая недостаточность костного мозга, проявляющаяся аномальной пигментацией кожи, лейкоплакией (белым утолщением слизистой оболочки полости рта) и дистрофией ногтей, а также рядом других симптомов. У людей с мутациями в генах TERC или DKC1 теломеры короче и активность теломеразы снижена in vitro по сравнению с другими людьми того же возраста. В одной семье аутосомно-доминантный DC был связан с гетерозиготной мутацией в гене TERT. У этих пациентов также отмечалось ускоренное укорочение теломер и генетическая предвосхищаемость (то есть, фенотип DC усугублялся с каждым поколением).