Цикл Кребса: биохимические реакции высвобождения энергии

Введение

Взаимосвязанные биохимические реакции, высвобождающие энергию.

Цикл лимонной кислоты, также известный как цикл Кребса, цикл Сент-Дьердьи–Кребса или цикл ТКК (цикл трикарбоновых кислот), – это серия биохимических реакций, высвобождающих энергию, запасенную в питательных веществах, посредством окисления ацетил-КоА, получаемого из углеводов, жиров и белков. Высвобождающаяся химическая энергия становится доступной в форме АТФ. Цикл Кребса используется организмами, осуществляющими дыхание (в отличие от организмов, осуществляющих брожение), для получения энергии посредством анаэробного или аэробного дыхания. Кроме того, цикл предоставляет предшественники для некоторых аминокислот, а также восстановитель NADH, используемый во множестве других реакций. Его центральная роль во многих биохимических путях позволяет предположить, что он был одним из самых ранних компонентов метаболизма. Несмотря на то, что он называется "циклом", метаболиты не обязательно должны следовать только одному конкретному маршруту; известно как минимум три альтернативных участка цикла лимонной кислоты. Название этого метаболического пути происходит от лимонной кислоты (трикарбоновой кислоты, часто называемой цитратом, поскольку в биологических условиях преобладает ее ионизированная форма).

Открытие

Некоторые компоненты и реакции цикла лимонной кислоты были установлены в 1930-х годах в ходе исследований Альберта Сент-Дьёрги, который получил Нобелевскую премию по физиологии или медицине в 1937 году именно за открытия, связанные с фумаровой кислотой – компонентом цикла. Это открытие он сделал, изучая грудную мускулатуру голубей. Благодаря тому, что эта ткань хорошо сохраняет свою окислительную способность даже после измельчения в мельнице Латапи и высвобождения в водные растворы, грудная мускулатура голубей оказалась очень подходящим объектом для изучения окислительных реакций. Сам цикл лимонной кислоты был окончательно идентифицирован в 1937 году Хансом Адольфом Кребсом и Уильямом Артуром Джонсоном, работавшими в Университете Шеффилда, за что Кребс получил Нобелевскую премию по физиологии или медицине в 1953 году, и в честь которого цикл иногда называют циклом Кребса.

Изменение

В то время как цикл лимонной кислоты в целом высоко консервативен, наблюдается значительная вариабельность в ферментах, обнаруженных у разных таксонов (следует отметить, что схемы на этой странице специфичны для варианта пути у млекопитающих). Существуют некоторые различия между эукариотами и прокариотами. Преобразование D-треоизоцитрата в 2-оксоглутарат катализируется у эукариотов NAD+-зависимой EC 1.1.1.41, в то время как прокариоты используют NADP+-зависимую EC 1.1.1.42. Аналогично, преобразование (S)-малата в оксалоацетат катализируется у эукариотов NAD+-зависимой EC 1.1.1.37, в то время как большинство прокариотов используют хинон-зависимый фермент EC 1.1.5.4. Шаг с существенной вариабельностью – преобразование сукцинил-КоА в сукцинат. Большинство организмов используют EC 6.2.1.5, сукцинат-КоА лигазу (формирующую АДФ) (несмотря на название, фермент действует в направлении образования АДФ). У млекопитающих также функционирует фермент, формирующий ГТФ, сукцинат-КоА лигаза (формирующая ВТФ) (EC 6.2.1.4). Степень использования каждой изоформы зависит от ткани. В некоторых бактериях, продуцирующих ацетат, таких как *Acetobacter aceti*, совершенно другой фермент катализирует это преобразование – EC 2.8.3.18, сукцинил-КоА:ацетат-КоА трансфераза. Этот специализированный фермент связывает цикл ТЦА с метаболизмом ацетата в этих организмах. Некоторые бактерии, такие как *Helicobacter pylori*, используют для этого преобразования другой фермент – сукцинил-КоА:ацетоацетат-КоА трансферазу (EC 2.8.3.5). Некоторая вариабельность наблюдается и на предыдущем этапе – преобразовании 2-оксоглутарата в сукцинил-КоА. В то время как большинство организмов используют повсеместную NAD+-зависимую 2-оксоглутаратдегидрогеназу, некоторые бактерии используют ферредоксин-зависимую 2-оксоглутаратсинтазу (EC 1.2.7.3). Другие организмы, включая облигатно автотрофные и метанотрофные бактерии и археи, полностью обходят сукцинил-КоА и преобразуют 2-оксоглутарат в сукцинат через сукцинат-полуальдегид, используя EC 4.1.1.71, 2-оксоглутаратдекарбоксилазу, и EC 1.2.1.79, сукцинат-полуальдегиддегидрогеназу. При раке происходят существенные метаболические нарушения, обеспечивающие пролиферацию опухолевых клеток, и, следовательно, могут накапливаться метаболиты, способствующие опухолеобразованию, известные как онкометаболиты. Среди наиболее хорошо изученных онкометаболитов – 2-гидроксиглутарат, который образуется в результате гетерозиготного усиления функции (в частности, неоморфного) в изоцитратдегидрогеназе (IDH) (которая при нормальных обстоятельствах катализирует окисление изоцитрата в оксалосукцинат, который затем спонтанно декарбоксилируется в α-кетоглутарат, как обсуждалось выше; в этом случае после образования α-кетоглутарата через NADPH происходит дополнительный этап восстановления с образованием 2-гидроксиглутарата), и, следовательно, IDH считается онкогеном. В физиологических условиях 2-гидроксиглутарат является побочным продуктом нескольких метаболических путей, возникающим в результате ошибки, но легко преобразуется в α-кетоглутарат ферментами гидроксиглутаратдегидрогеназы (L2HGDH и D2HGDH), однако не имеет известной физиологической роли в клетках млекопитающих; примечательно, что при раке 2-гидроксиглутарат, вероятно, является конечным метаболитом, поскольку эксперименты по изотопной метке клеточных линий колоректального рака показывают, что его обратное преобразование в α-кетоглутарат слишком мало для измерения. При раке 2-гидроксиглутарат служит конкурентным ингибитором ряда ферментов, катализирующих реакции с участием α-кетоглутарата в α-кетоглутарат-зависимых диоксигеназах. Эта мутация приводит к нескольким важным изменениям в метаболизме клетки. Во-первых, поскольку происходит дополнительное восстановление, катализируемое NADPH, это может способствовать истощению клеточных запасов NADPH и снижению уровня α-кетоглутарата, доступного клетке. В частности, истощение NADPH является проблематичным, поскольку NADPH сильно компартментализируется и не может свободно диффундировать между органеллами в клетке. Он в основном образуется в цитоплазме посредством пентозофосфатного пути. Истощение NADPH приводит к увеличению окислительного стресса в клетке, поскольку он является необходимым кофактором в производстве ГШ, и этот окислительный стресс может привести к повреждению ДНК. Также происходят изменения на генетическом и эпигенетическом уровне посредством функционирования гистонлизин-деметилаз (KDMs) и ферментов переносчика одиннадцать (TET); обычно TET гидроксилируют 5-метилцитозины для подготовки их к деметилированию. Однако в отсутствие α-кетоглутарата это невозможно, и, следовательно, происходит гиперметилирование ДНК клетки, способствующее эпителиально-мезенхимальному переходу (EMT) и подавлению дифференцировки клеток. Аналогичное явление наблюдается для семейства KDMs Jumonji C, которым требуется гидроксилирование для выполнения деметилирования в ε-аминометильной группе. Кроме того, неспособность пролилгидроксилаз катализировать реакции приводит к стабилизации фактора, индуцируемого гипоксией α, который необходим для содействия его деградации (поскольку в условиях низкой концентрации кислорода не будет достаточного субстрата для гидроксилирования). Это приводит к псевдогипоксическому фенотипу в опухолевой клетке, который способствует ангиогенезу, метаболическому перепрограммированию, росту и миграции клеток.

While the citric acid cycle is in general highly conserved, there is significant variability in the enzymes found in different taxa (note that the diagrams on this page are specific to the mammalian pathway variant). Some differences exist between eukaryotes and prokaryotes. The conversion of D threo isocitrate to 2 oxoglutarate is catalyzed in eukaryotes by the NAD+ dependent EC 1.1.1.41, while prokaryotes employ the NADP+ dependent EC 1.1.1.42. Similarly, the conversion of (S) malate to oxaloacetate is catalyzed in eukaryotes by the NAD+ dependent EC 1.1.1.37, while most prokaryotes utilize a quinone dependent enzyme, EC 1.1.5.4. A step with significant variability is the conversion of succinyl CoA to succinate. Most organisms utilize EC 6.2.1.5, succinate–CoA ligase (ADP forming) (despite its name, the enzyme operates in the pathway in the direction of ATP formation). In mammals a GTP forming enzyme, succinate–CoA ligase (GDP forming) (EC 6.2.1.4) also operates. The level of utilization of each isoform is tissue dependent. In some acetate producing bacteria, such as Acetobacter aceti, an entirely different enzyme catalyzes this conversion – EC 2.8.3.18, succinyl CoA:acetate CoA transferase. This specialized enzyme links the TCA cycle with acetate metabolism in these organisms. Some bacteria, such as Helicobacter pylori, employ yet another enzyme for this conversion – succinyl CoA:acetoacetate CoA transferase (EC 2.8.3.5). Some variability also exists at the previous step – the conversion of 2 oxoglutarate to succinyl CoA. While most organisms utilize the ubiquitous NAD+ dependent 2 oxoglutarate dehydrogenase, some bacteria utilize a ferredoxin dependent 2 oxoglutarate synthase (EC 1.2.7.3). Other organisms, including obligately autotrophic and methanotrophic bacteria and archaea, bypass succinyl CoA entirely, and convert 2 oxoglutarate to succinate via succinate semialdehyde, using EC 4.1.1.71, 2 oxoglutarate decarboxylase, and EC 1.2.1.79, succinate semialdehyde dehydrogenase. In cancer, there are substantial metabolic derangements that occur to ensure the proliferation of tumor cells, and consequently metabolites can accumulate which serve to facilitate tumorigenesis, dubbed oncometabolites. Among the best characterized oncometabolites is 2 hydroxyglutarate which is produced through a heterozygous gain of function mutation (specifically a neomorphic one) in isocitrate dehydrogenase (IDH) (which under normal circumstances catalyzes the oxidation of isocitrate to oxalosuccinate, which then spontaneously decarboxylates to alpha ketoglutarate, as discussed above; in this case an additional reduction step occurs after the formation of alpha ketoglutarate via NADPH to yield 2 hydroxyglutarate), and hence IDH is considered an oncogene. Under physiological conditions, 2 hydroxyglutarate is a minor product of several metabolic pathways as an error but readily converted to alpha ketoglutarate via hydroxyglutarate dehydrogenase enzymes (L2HGDH and D2HGDH) but does not have a known physiologic role in mammalian cells; of note, in cancer, 2 hydroxyglutarate is likely a terminal metabolite as isotope labelling experiments of colorectal cancer cell lines show that its conversion back to alpha ketoglutarate is too low to measure. In cancer, 2 hydroxyglutarate serves as a competitive inhibitor for a number of enzymes that facilitate reactions via alpha ketoglutarate in alpha ketoglutarate dependent dioxygenases. This mutation results in several important changes to the metabolism of the cell. For one thing, because there is an extra NADPH catalyzed reduction, this can contribute to depletion of cellular stores of NADPH and also reduce levels of alpha ketoglutarate available to the cell. In particular, the depletion of NADPH is problematic because NADPH is highly compartmentalized and cannot freely diffuse between the organelles in the cell. It is produced largely via the pentose phosphate pathway in the cytoplasm. The depletion of NADPH results in increased oxidative stress within the cell as it is a required cofactor in the production of GSH, and this oxidative stress can result in DNA damage. There are also changes on the genetic and epigenetic level through the function of histone lysine demethylases (KDMs) and ten eleven translocation (TET) enzymes; ordinarily TETs hydroxylate 5 methylcytosines to prime them for demethylation. However, in the absence of alpha ketoglutarate this cannot be done and there is hence hypermethylation of the cell's DNA, serving to promote epithelial mesenchymal transition (EMT) and inhibit cellular differentiation. A similar phenomenon is observed for the Jumonji C family of KDMs which require a hydroxylation to perform demethylation at the epsilon amino methyl group. Additionally, the inability of prolyl hydroxylases to catalyze reactions results in stabilization of hypoxia inducible factor alpha, which is necessary to promote degradation of the latter (as under conditions of low oxygen there will not be adequate substrate for hydroxylation). This results in a pseudohypoxic phenotype in the cancer cell that promotes angiogenesis, metabolic reprogramming, cell growth, and migration.

Регулирование

Аллостерическая регуляция метаболитами. Регулирование цикла трикарбоновых кислот во многом определяется ингибированием продуктами реакции и доступностью субстратов. Если бы цикл работал бесконтрольно, значительное количество метаболической энергии могло бы быть потрачено на избыточное производство восстановленных коферментов, таких как NADH и ATP. Основным конечным субстратом цикла является АДФ, который превращается в АТФ. Снижение концентрации АДФ приводит к накоплению предшественника NADH, который, в свою очередь, может ингибировать ряд ферментов. NADH, продукт всех дегидрогеназ цикла трикарбоновых кислот, за исключением сукцинатдегидрогеназы, ингибирует пируватдегидрогеназу, изоцитратдегидрогеназу, α-кетоглутаратдегидрогеназу, а также цитратсинтазу. Ацетил-КоА ингибирует пируватдегидрогеназу, в то время как сукцинил-КоА ингибирует α-кетоглутаратдегидрогеназу и цитратсинтазу. При тестировании *in vitro* с ферментами цикла трикарбоновых кислот, ATP ингибирует цитратсинтазу и α-кетоглутаратдегидрогеназу; однако, уровни ATP не изменяются более чем на 10% *in vivo* между состоянием покоя и интенсивными физическими упражнениями. Не существует известного аллостерического механизма, который мог бы объяснить значительные изменения скорости реакции под действием аллостерического эффектора, концентрация которого изменяется менее чем на 10%. Цитрат используется для ингибирования обратной связи, поскольку он ингибирует фосфофруктокиназу, фермент, участвующий в гликолизе, который катализирует образование фруктозы-1,6-бисфосфата, предшественника пирувата. Это предотвращает поддержание постоянно высокой скорости потока при накоплении цитрата и снижении концентрации субстрата для фермента. Регуляция кальцием. Кальций также используется в качестве регулятора цикла трикарбоновых кислот. Концентрация кальция в митохондриальном матриксе может достигать десятков микромолярных значений во время активации клеток. Он активирует пируватдегидрогеназафосфатазу, которая, в свою очередь, активирует пируватдегидрогеназный комплекс. Кальций также активирует изоцитратдегидрогеназу и α-кетоглутаратдегидрогеназу. Это увеличивает скорость реакции многих стадий цикла и, следовательно, увеличивает поток по всему пути. Транскрипционная регуляция. Существует связь между промежуточными продуктами цикла трикарбоновых кислот и регуляцией факторов, индуцируемых гипоксией (HIF). HIF играет роль в регуляции кислородного гомеостаза и является транскрипционным фактором, который воздействует на ангиогенез, ремоделирование сосудов, утилизацию глюкозы, транспорт железа и апоптоз. HIF синтезируется конститутивно, и гидроксилирование по крайней мере одного из двух критических остатков пролина опосредует их взаимодействие с комплексом E3-убиквитинлигазы фон Гиппеля-Линдау, который направляет их на быструю деградацию. Эта реакция катализируется пролил-4-гидроксилазами. Фумарат и сукцинат были идентифицированы как мощные ингибиторы пролилгидроксилаз, что приводит к стабилизации HIF.

Allosteric regulation by metabolites. The regulation of the citric acid cycle is largely determined by product inhibition and substrate availability. If the cycle were permitted to run unchecked, large amounts of metabolic energy could be wasted in overproduction of reduced coenzyme such as NADH and ATP. The major eventual substrate of the cycle is ADP which gets converted to ATP. A reduced amount of ADP causes accumulation of precursor NADH which in turn can inhibit a number of enzymes. NADH, a product of all dehydrogenases in the citric acid cycle with the exception of succinate dehydrogenase, inhibits pyruvate dehydrogenase, isocitrate dehydrogenase, α ketoglutarate dehydrogenase, and also citrate synthase. Acetyl coA inhibits pyruvate dehydrogenase, while succinyl CoA inhibits alpha ketoglutarate dehydrogenase and citrate synthase. When tested in vitro with TCA enzymes, ATP inhibits citrate synthase and α ketoglutarate dehydrogenase; however, ATP levels do not change more than 10% in vivo between rest and vigorous exercise. There is no known allosteric mechanism that can account for large changes in reaction rate from an allosteric effector whose concentration changes less than 10%. Citrate is used for feedback inhibition, as it inhibits phosphofructokinase, an enzyme involved in glycolysis that catalyses formation of fructose 1,6 bisphosphate, a precursor of pyruvate. This prevents a constant high rate of flux when there is an accumulation of citrate and a decrease in substrate for the enzyme. Regulation by calcium. Calcium is also used as a regulator in the citric acid cycle. Calcium levels in the mitochondrial matrix can reach up to the tens of micromolar levels during cellular activation. It activates pyruvate dehydrogenase phosphatase which in turn activates the pyruvate dehydrogenase complex. Calcium also activates isocitrate dehydrogenase and α ketoglutarate dehydrogenase. This increases the reaction rate of many of the steps in the cycle, and therefore increases flux throughout the pathway. Transcriptional regulation. There is a link between intermediates of the citric acid cycle and the regulation of hypoxia inducible factors (HIF). HIF plays a role in the regulation of oxygen homeostasis, and is a transcription factor that targets angiogenesis, vascular remodeling, glucose utilization, iron transport and apoptosis. HIF is synthesized constitutively, and hydroxylation of at least one of two critical proline residues mediates their interaction with the von Hippel Lindau E3 ubiquitin ligase complex, which targets them for rapid degradation. This reaction is catalysed by prolyl 4 hydroxylases. Fumarate and succinate have been identified as potent inhibitors of prolyl hydroxylases, thus leading to the stabilisation of HIF.

Промежуточные продукты циклона лимонной кислоты служат субстратами для биосинтетических процессов

В этом подразделе, как и в предыдущем, промежуточные соединения цикла Кребса выделены курсивом. Ряд промежуточных продуктов цикла лимонной кислоты используются для синтеза важных соединений, что оказывает значительное катаплеротическое влияние на цикл. Цитозольный ацетил-КоА используется для синтеза жирных кислот и выработки холестерина. Холестерин, в свою очередь, может быть использован для синтеза стероидных гормонов, желчных кислот и витамина D.

Эволюция

Считается, что компоненты цикла лимонной кислоты произошли от анаэробных бактерий, и что сам цикл ТСА мог эволюционировать не один раз. Он мог даже предшествовать возникновению жизни: субстраты, по-видимому, способны спонтанно вступать в большинство реакций в присутствии персульфатных радикалов. Теоретически существуют альтернативы циклу ТСА, однако цикл ТСА представляется наиболее эффективным. Если несколько альтернатив циклу ТСА эволюционировали независимо, то все они, по всей видимости, сошлись к циклу ТСА.