Нейроспора красса: генетика, биология и применение в исследованиях.

Введение

Вид аскомицетного гриба из семейства Sordariaceae.

Neurospora crassa – это вид красной хлебной плесени из отдела Ascomycota. Название рода, означающее «нервный спора» на греческом языке, относится к характерной полосатости спор. Первое опубликованное описание этого гриба связано с заражением французских пекарен в 1843 году. Neurospora crassa используется в качестве модельного организма, поскольку её легко выращивать, и она имеет гаплоидный жизненный цикл, что упрощает генетический анализ, так как рецессивные признаки проявляются у потомства. Анализ генетической рекомбинации облегчается упорядоченным расположением продуктов мейоза в аскоспорах Neurospora. Полный геном, состоящий из семи хромосом, был секвенирован. Edward Tatum и George Wells Beadle использовали Neurospora в своих экспериментах, за которые они получили Нобелевскую премию по физиологии и медицине в 1958 году. Beadle и Tatum подвергали N. crassa воздействию рентгеновских лучей, вызывая мутации. Затем они наблюдали нарушения в метаболических путях, вызванные ошибками в специфических ферментах. Это привело их к формулировке гипотезы «один ген – один фермент», согласно которой конкретные гены кодируют конкретные белки. Norman Horowitz позднее расширил эту гипотезу до ферментных путей, также работая с Neurospora. Как вспоминал Norman Horowitz в 2004 году: «Эти эксперименты заложили основу науки, которую Beadle и Tatum назвали «биохимической генетикой». Фактически, они стали отправной точкой для развития молекулярной генетики и всех последующих достижений в этой области». В выпуске журнала Nature от 24 апреля 2003 года было сообщено о полном секвенировании генома N. crassa. Геном имеет длину около 43 мегабаз и содержит приблизительно 10 000 генов. В настоящее время реализуется проект по созданию штаммов, содержащих нокаутные мутанты для каждого гена N. crassa. В своей естественной среде обитания N. crassa преимущественно встречается в тропических и субтропических регионах. Её можно обнаружить растущей на мертвой растительности после пожаров. Neurospora активно используется в исследованиях по всему миру и играет важную роль в изучении молекулярных механизмов, связанных с циркадными ритмами, эпигенетикой и подавлением генов, полярностью клеток, слиянием клеток, развитием, а также многими аспектами клеточной биологии и биохимии.

Neurospora crassa is a type of red bread mold of the phylum Ascomycota. The genus name, meaning 'nerve spore' in Greek, refers to the characteristic striations on the spores. The first published account of this fungus was from an infestation of French bakeries in 1843. Neurospora crassa is used as a model organism because it is easy to grow and has a haploid life cycle that makes genetic analysis simple since recessive traits will show up in the offspring. Analysis of genetic recombination is facilitated by the ordered arrangement of the products of meiosis in Neurospora ascospores. Its entire genome of seven chromosomes has been sequenced. Neurospora was used by Edward Tatum and George Wells Beadle in their experiments for which they won the Nobel Prize in Physiology or Medicine in 1958. Beadle and Tatum exposed N. crassa to x rays, causing mutations. They then observed failures in metabolic pathways caused by errors in specific enzymes. This led them to propose the "one gene, one enzyme" hypothesis that specific genes code for specific proteins. Their hypothesis was later elaborated to enzyme pathways by Norman Horowitz, also working on Neurospora. As Norman Horowitz reminisced in 2004, "These experiments founded the science of what Beadle and Tatum called 'biochemical genetics'. In actuality, they proved to be the opening gun in what became molecular genetics and all developments that have followed from that." In the 24 April 2003 issue of Nature, the genome of N. crassa was reported as completely sequenced. The genome is about 43 megabases long and includes approximately 10,000 genes. There is a project underway to produce strains containing knockout mutants of every N. crassa gene. In its natural environment, N. crassa lives mainly in tropical and sub tropical regions. It can be found growing on dead plant matter after fires. Neurospora is actively used in research around the world. It is important in the elucidation of molecular events involved in circadian rhythms, epigenetics and gene silencing, cell polarity, cell fusion, development, as well as many aspects of cell biology and biochemistry.

Сексуальный цикл

Половые плодоносящие тела (перитеции) могут формироваться только при контакте двух мицелиев разного типа спаривания (см. рисунок). Как и другие аскомицеты, N. crassa имеет два типа спаривания, обозначаемые в данном случае A и a. Очевидных морфологических различий между штаммами типов A и a нет. Оба типа способны формировать обильные протоперитеции – женские репродуктивные структуры (см. рисунок). Протоперитеции наиболее легко образуются в лаборатории при росте на твердой (агарной) синтетической среде с относительно низким содержанием азота. Похоже, что дефицит азота необходим для экспрессии генов, вовлеченных в половое развитие. Протоперитеций состоит из аскогониума – спирально закрученной многоклеточной гифы, заключенной в узел из переплетенных гиф. От кончика аскогониума отходит разветвленная система тонких гиф, называемая трихогиной, которая простирается за пределы окружающих гиф в воздух. Половой цикл инициируется (то есть происходит оплодотворение), когда клетка (обычно конидия) противоположного типа спаривания контактирует с частью трихогины (см. рисунок). Этот контакт может привести к слиянию клеток, в результате чего одно или несколько ядер оплодотворяющей клетки мигрируют вниз по трихогине в аскогоний. Поскольку штаммы A и a имеют одинаковые половые структуры, ни один из них нельзя считать исключительно мужским или женским. Однако протоперитеций как штаммов A, так и a можно рассматривать как женскую структуру, а оплодотворяющую конидию – как мужской вклад. Последующие этапы после слияния гаплоидных клеток A и a были описаны Финчамом и Дэй, а также Вагнером и Митчеллом. После слияния клеток дальнейшее слияние их ядер задерживается. Вместо этого ядро из оплодотворяющей клетки и ядро из аскогониума объединяются и начинают делиться синхронно. Продукты этих ядерных делений (все еще в парах разных типов спаривания, то есть A/a) мигрируют в многочисленные аскогенные гифы, которые затем начинают расти из аскогониума. Каждая из этих аскогенных гиф изгибается, образуя крючок (или крузье) на конце, и пара гаплоидных ядер A и a внутри крючка делится синхронно. Затем формируются перегородки, разделяющие крючок на три клетки. Центральная клетка в изгибе крючка содержит одно ядро A и одно ядро a (см. рисунок). Эта двухъядерная клетка инициирует формирование аскуса и называется "первичной" клеткой аскуса. Далее две одноядерные клетки по обе стороны от первой образующей аскус клетки сливаются, образуя двухъядерную клетку, которая может расти и формировать новый крючок, способный образовать свою собственную первичную клетку аскуса. Этот процесс может повторяться несколько раз. После формирования первичной клетки аскуса ядра A и a сливаются, образуя диплоидное ядро (см. рисунок). Это ядро – единственное диплоидное ядро во всем жизненном цикле N. crassa. Диплоидное ядро содержит 14 хромосом, образованных в результате слияния двух гаплоидных ядер, каждое из которых имело по 7 хромосом. Образование диплоидного ядра немедленно сопровождается мейозом. Два последовательных деления мейоза приводят к образованию четырех гаплоидных ядер: двух типов A и двух типов a. Еще одно митотическое деление приводит к образованию четырех ядер A и четырех ядер a в каждом аскусе. Мейоз является важной частью жизненного цикла всех половозрелых организмов, и в основных чертах мейоз у N. crassa типичен для мейоза в целом. Параллельно с этими событиями мицелиальная оболочка, окружавшая аскогоний, развивается в стенку перитеция, пропитывается меланином и чернеет. Зрелый перитеций имеет форму колбы. В зрелом перитеции может содержаться до 300 аскусов, каждый из которых произошел от идентичных диплоидных ядер. Обычно в природе, когда перитеции созревают, аскоспоры энергично выбрасываются в воздух. Эти аскоспоры устойчивы к нагреванию и в лабораторных условиях для их прорастания требуется нагревание при 60 °C в течение 30 минут. Для нормальных штаммов весь половой цикл занимает от 10 до 15 дней. В зрелом аскусе, содержащем восемь аскоспор, пары соседних спор генетически идентичны, поскольку последнее деление – митотическое, и поскольку аскоспоры заключены в аскус, который удерживает их в определенном порядке, определяемом направлением расхождения ядер во время мейоза. Поскольку четыре первичных продукта также расположены последовательно, можно различить схему расхождения генетических маркеров при первом делении и схему расхождения при втором делении.

Sexual fruiting bodies (perithecia) can only be formed when two mycelia of different mating type come together (see Figure). Like other Ascomycetes, N. crassa has two mating types that, in this case, are symbolized by A and a. There is no evident morphological difference between the A and a mating type strains. Both can form abundant protoperithecia, the female reproductive structure (see Figure). Protoperithecia are formed most readily in the laboratory when growth occurs on solid (agar) synthetic medium with a relatively low source of nitrogen. Nitrogen starvation appears to be necessary for expression of genes involved in sexual development. The protoperithecium consists of an ascogonium, a coiled multicellular hypha that is enclosed in a knot like aggregation of hyphae. A branched system of slender hyphae, called the trichogyne, extends from the tip of the ascogonium projecting beyond the sheathing hyphae into the air. The sexual cycle is initiated (i. e. fertilization occurs) when a cell (usually a conidium) of opposite mating type contacts a part of the trichogyne (see Figure). Such contact can be followed by cell fusion leading to one or more nuclei from the fertilizing cell migrating down the trichogyne into the ascogonium. Since both A and a strains have the same sexual structures, neither strain can be regarded as exclusively male or female. However, as a recipient, the protoperithecium of both the A and a strains can be thought of as the female structure, and the fertilizing conidium can be thought of as the male participant. The subsequent steps following fusion of A and a haploid cells, have been outlined by Fincham and Day and Wagner and Mitchell. After fusion of the cells, the further fusion of their nuclei is delayed. Instead, a nucleus from the fertilizing cell and a nucleus from the ascogonium become associated and begin to divide synchronously. The products of these nuclear divisions (still in pairs of unlike mating type, i. e. A/a) migrate into numerous ascogenous hyphae, which then begin to grow out of the ascogonium. Each of these ascogenous hypha bends to form a hook (or crozier) at its tip and the A and a pair of haploid nuclei within the crozier divide synchronously. Next, septa form to divide the crozier into three cells. The central cell in the curve of the hook contains one A and one a nucleus (see Figure). This binuclear cell initiates ascus formation and is called an "ascus initial" cell. Next the two uninucleate cells on either side of the first ascus forming cell fuse with each other to form a binucleate cell that can grow to form a further crozier that can then form its own ascus initial cell. This process can then be repeated multiple times. After formation of the ascus initial cell, the A and a nucleus fuse with each other to form a diploid nucleus (see Figure). This nucleus is the only diploid nucleus in the entire life cycle of N. crassa. The diploid nucleus has 14 chromosomes formed from the two fused haploid nuclei that had 7 chromosomes each. Formation of the diploid nucleus is immediately followed by meiosis. The two sequential divisions of meiosis lead to four haploid nuclei, two of the A mating type and two of the a mating type. One further mitotic division leads to four A and four a nucleus in each ascus. Meiosis is an essential part of the life cycle of all sexually reproducing organisms, and in its main features, meiosis in N. crassa seems typical of meiosis generally. As the above events are occurring, the mycelial sheath that had enveloped the ascogonium develops as the wall of the perithecium, becomes impregnated with melanin, and blackens. The mature perithecium has a flask shaped structure. A mature perithecium may contain as many as 300 asci, each derived from identical fusion diploid nuclei. Ordinarily, in nature, when the perithecia mature the ascospores are ejected rather violently into the air. These ascospores are heat resistant and, in the lab, require heating at 60 °C for 30 minutes to induce germination. For normal strains, the entire sexual cycle takes 10 to 15 days. In a mature ascus containing eight ascospores, pairs of adjacent spores are identical in genetic constitution, since the last division is mitotic, and since the ascospores are contained in the ascus sac that holds them in a definite order determined by the direction of nuclear segregations during meiosis. Since the four primary products are also arranged in sequence, a first division segregation pattern of genetic markers can be distinguished from a second division segregation pattern.

Анализ мелкоструктурной генетики

Из-за вышеуказанных особенностей N. crassa оказался очень полезным для изучения генетических событий, происходящих в отдельных мейозах. Зрелые аски из перитеция можно отделить на микроскопическом слайде и экспериментально манипулировать спорами. Эти исследования обычно включали отдельную культуру отдельных аскоспор, полученных в результате одного мейотического события, и определение генотипа каждой споры. Исследования такого типа, проведенные в нескольких различных лабораториях, установили феномен «конверсии генов» (например, см. ссылки). В качестве примера феномена конверсии генов рассмотрим генетические скрещивания двух мутантных штаммов N. crassa с дефектом в гене pan 2. Этот ген необходим для синтеза пантотеновой кислоты (витамина B5), и мутанты с дефектом в этом гене могут быть экспериментально идентифицированы по их потребности в пантотеновой кислоте в среде для роста. Две мутации pan 2, B5 и B3, расположены в разных участках гена pan 2, поэтому скрещивание B5 × B3 дает рекомбинанты дикого типа с низкой частотой. Это привело к обширной характеристике конверсии генов. Из этих работ стало ясно, что события конверсии генов возникают, когда молекулярное рекомбинационное событие происходит вблизи изучаемых генетических маркеров (например, мутаций pan 2 в приведенном выше примере). Таким образом, изучение конверсии генов позволило получить представление о деталях молекулярного механизма рекомбинации. За десятилетия, прошедшие с момента первоначальных наблюдений Мэри Митчелл в 1955 году, эти мутации, будучи гомозиготными на диплоидной стадии, часто вызывают дефекты созревания спор или приводят к образованию бесплодных плодовых тел с небольшим количеством аскоспор (половых спор). Большинство этих гомозиготных мутаций вызывают аномальный мейоз (например, нарушение спаривания хромосом или стадии пахитены или диплотены). Количество генов, влияющих на диплоидную стадию, оценивалось как минимум в 435 (около 4% от общего числа 9730 генов). Таким образом, ауткроссинг, стимулируемый необходимостью объединения противоположных типов спаривания, вероятно, обеспечивает преимущество в маскировке рецессивных мутаций, которые в противном случае были бы вредны для образования половых спор (см. Комплементация (генетика)).

Because of the above features N. crassa was found to be very useful for the study of genetic events occurring in individual meioses. Mature asci from a perithecium can be separated on a microscope slide and the spores experimentally manipulated. These studies usually involved the separate culture of individual ascospores resulting from a single meiotic event and determining the genotype of each spore. Studies of this type, carried out in several different laboratories, established the phenomenon of "gene conversion" (e. g. see references). As an example of the gene conversion phenomenon, consider genetic crosses of two N. crassa mutant strains defective in gene pan 2. This gene is necessary for the synthesis of pantothenic acid (vitamin B5), and mutants defective in this gene can be experimentally identified by their requirement for pantothenic acid in their growth medium. The two pan 2 mutations B5 and B3 are located at different sites in the pan 2 gene, so that a cross of B5 ´ B3 yields wild type recombinants at low frequency. ), led to an extensive characterization of gene conversion. It became clear from this work that gene conversion events arise when a molecular recombination event happens to occur near the genetic markers under study (e. g. pan 2 mutations in the above example). Thus studies of gene conversion allowed insight into the details of the molecular mechanism of recombination. Over the decades since the original observations of Mary Mitchell in 1955, These mutations, when homozygous in the diploid stage, often cause spores to have maturation defects or to produce barren fruiting bodies with few ascospores (sexual spores). Most of these homozygous mutations cause abnormal meiosis (e. g., disturbed chromosome pairing or pachytene or diplotene). The number of genes affecting the diploid stage was estimated to be at least 435 (about 4% of the total number of 9,730 genes). Thus, outcrossing, promoted by the necessity for the union of opposite mating types, likely provides the benefit of masking recessive mutations that would otherwise be harmful to sexual spore formation (see Complementation (genetics)).

Текущие исследования

Нейроспора красса — не только модельный организм для изучения фенотипических типов в нокаутных вариантах, но и особенно полезный организм, широко используемый в вычислительной биологии и исследовании циркадных ритмов. Она имеет естественный репродуктивный цикл продолжительностью 22 часа и подвержена влиянию внешних факторов, таких как свет и температура. Нокаутные варианты дикого типа N. crassa широко изучаются для определения влияния конкретных генов (см. Частота (ген)).