Осаждение сульфатом аммония в очистке белков: механизм и применение.

Введение

Осаждение сульфатом аммония — один из наиболее распространенных методов очистки и фракционирования белков как в промышленных, так и в лабораторных масштабах, позволяющий разделять белки путем изменения их растворимости при высокой концентрации соли.

Свойства

Сульфат аммония – неорганическая соль с высокой растворимостью, которая в водных растворах диссоциирует на ионы аммония (NH4+) и сульфата (SO42−). Сульфат аммония особенно полезен в качестве осадителя, поскольку обладает высокой растворимостью, стабилизирует структуру белков, имеет относительно низкую плотность, широко доступен и относительно дешев.

Механизм

Сульфат аммония, как и другие нейтральные соли, стабилизирует белки за счет преференциальной сольватации. Белки обычно хранят в сульфате аммония, поскольку он ингибирует рост бактерий. С добавлением сульфата аммония белки, развернутые денатурирующими веществами, могут быть возвращены в свои нативные конформации. Это наблюдается при сворачивании рекомбинантных белков. Растворимость белков изменяется в зависимости от ионной силы раствора, а следовательно, и от концентрации соли. При низких концентрациях ионов (менее 0,5 моль/л) растворимость белков увеличивается с ростом концентрации соли, этот эффект называется "высаливанием". При дальнейшем увеличении концентрации соли растворимость белка начинает уменьшаться. При достаточно высокой ионной силе белок выпадает в осадок из раствора, этот эффект называется "высаливанием". Ионы аммония (NH4+) и сульфата (SO42-) в водном растворе притягиваются к противоположным зарядам, присутствующим в очищаемом соединении. Это притяжение противоположных зарядов препятствует взаимодействию молекул воды с очищаемым соединением, что приводит к осаждению или "высаливанию". Механизм высаливания заключается в исключении соли из водного слоя, тесно связанного с поверхностью белка, известного как гидратационный слой. Гидратационный слой играет важную роль в поддержании растворимости и подходящей нативной конформации. Существуют три основных типа взаимодействия белка с водой: ионная гидратация между заряженными боковыми цепями, водородные связи между полярными группами и водой, а также гидрофобная гидратация. После добавления соли в смесь увеличивается поверхностное натяжение воды, что усиливает гидрофобные взаимодействия между водой и целевым белком. Целевой белок уменьшает свою площадь поверхности, что снижает его контакт с растворителем. Это проявляется в сворачивании и самоассоциации, что в конечном итоге приводит к осаждению. Сворачивание и самоассоциация белка вытесняют свободную воду, что приводит к увеличению энтропии и делает этот процесс энергетически выгодным. Непосредственное добавление твердого сульфата аммония изменяет pH раствора, что может привести к потере активности фермента. В таких случаях в качестве альтернативы добавлению твердого сульфата аммония используется добавление насыщенного сульфата аммония в подходящий буфер. В любом случае полученный белковый осадок можно растворить отдельно в стандартном буфере и определить общее содержание белка. Концентрацию добавленного сульфата аммония следует увеличить до значения, которое позволит осадить большую часть целевого белка, оставляя максимальное количество белковых примесей в растворе. Осажденный целевой белок затем можно извлечь центрифугированием и растворить в стандартном буфере для подготовки образца к следующему этапу очистки. На следующем этапе очистки необходимо удалить всю добавленную соль из белка. Один из способов – диализ, но он дополнительно разбавляет концентрированный белок. Более эффективный способ удаления сульфата аммония из белка – смешивание осажденного белка в буфере, содержащем смесь SDS, Tris HCl и фенола, и последующее центрифугирование смеси. Осадок, полученный после центрифугирования, будет содержать белок с меньшей концентрацией соли.

Ammonium sulfate, as well as other neutral salts, will stabilize proteins by preferential solvation. Proteins are usually stored in ammonium sulfate because it inhibits bacterial growth. With the addition of ammonium sulfate, proteins unfolded by denaturants can be pushed into their native conformations. This can be seen with the folding of recombinant proteins. The solubility of proteins varies according to the ionic strength of the solution, thus according to the salt concentration. At low ion concentrations (less than 0.5 mol/L), the solubility of proteins increases with increasing salt concentration, an effect termed "salting in". As the salt concentration is further increased, the solubility of the protein begins to decrease. At a sufficiently high ionic strength, the protein will precipitate out of the solution, an effect termed "salting out". When the ammonium (NH4+) and sulfate (SO42 ) ions are within the aqueous solution they are attracted to the opposite charges evident on the compound that is being purified. This attraction of opposite charges prevents the water molecules from interacting with the compound being purified, leading to the precipitation or "salting out". With the mechanism of salting out, there is an omission of the salt from the layer of water, which is closely associated with the surface of the protein, known as the hydration layer. The hydration layer plays a vital role in sustaining solubility and suitable natural conformation. There are three main protein water interaction: ion hydration between charged side chains, hydrogen bonding between polar groups and water, and hydrophobic hydration. Once salt is added to the mixture, there is an increase in the surface tension of the water, thus increasing hydrophobic interactions between water and the protein of interest. The protein of interest then reduces its surface area, which diminishes its contact with the solvent. This is shown by the folding and self association, which ultimately leads to precipitation. The folding and self association of the protein pushes out free water, leading to an increase in entropy and making this process energetically favorable. The direct addition of solid ammonium sulfate does change the pH of the solution, which can lead to loss of enzyme activity. In those cases, the addition of saturated ammonium sulfate in a suitable buffer is used as an alternative to adding solid ammonium sulfate. In either approach, the resulting protein precipitate can be dissolved individually in a standard buffer and assayed to determine the total protein content. The ammonium sulfate concentration added should be increased to a value that will precipitate most of the protein of interest whilst leaving the maximum amount of protein contaminants still in the solution. The precipitated protein of interest can subsequently be recovered by centrifugation and dissolved in standard buffer to prepare the sample for the next stage of purification. In the next stage of purification, all this added salt needs to be removed from the protein. One way to do so is using dialysis, but dialysis further dilutes the concentrated protein. The better way of removing ammonium sulfate from the protein is mixing the precipitate protein in a buffer containing a mixture of SDS, Tris HCl, and phenol and centrifuging the mixture. The precipitate that comes out of this centrifugation will contain salt less concentrated protein.

Приложения

Осаждение сульфатом аммония – полезная техника, используемая в качестве начального этапа очистки белков, поскольку она позволяет быстро осадить большое количество клеточных белков. Она также часто применяется на более поздних стадиях очистки для концентрирования белка из разбавленных растворов после таких процедур, как гель-фильтрация. Недостатком этого метода является то, что вместе с белком часто могут осаждаться и другие вещества, поэтому требуются дополнительные методы очистки, такие как ионный обменный хроматографический анализ или гель-проникающая хроматография.