Ақуыз тазартуда аммоний сульфатының қолданылуы

Кіріспе

Аммиак сульфатының тұндыруы – ірі және зертханалық масштабтағы ақуыздарды тазарту және фракциялаудың ең көп қолданылатын әдістерінің бірі. Бұл әдіс жоғары тұз концентрациясының әсерінен ақуыздардың ерігіштігін өзгерту арқылы оларды бөлуге мүмкіндік береді.

Қасиеттері

Аммиак сульфаты – жоғары ерігіштігі бар бейорганикалық тұз, сулы ерітіндіде аммоний (NH4+) және сульфат (SO42−) иондарына ыдырайды. Аммиак сульфаты тұндырғыш ретінде ерекше пайдалы, себебі ол өте жақсы ериді, белок құрылымын тұрақтандырады, тығыздығы салыстырмалы түрде төмен, қолжетімді және салыстырмалы түрде арзан.

Механизм

Аммоний сульфаты, сондай-ақ басқа бейтарап тұздар, белоктарды артықшылықты еріту арқылы тұрақтандырады. Белоктар әдетте аммоний сульфатында сақталады, себебі ол бактериялардың өсуін тежейді. Аммоний сульфатының қосылуымен денатураторлармен жазылған белоктарды олардың табиғи конформациясына қайтаруға болады. Бұл рекомбинантты белоктардың бүктелуінен байқалады. Белоктардың ерігіштігі ерітіндідегі иондық күшке, яғни тұз концентрациясына байланысты өзгереді. Төмен иондық концентрацияда (0,5 моль/л-ден кем) белоктардың ерігіштігі тұз концентрациясының артуымен бірге артады, бұл эффект "тұздандыру" деп аталады. Тұз концентрациясы одан әрі артқанда белоктың ерігіштігі төмендеуі басталады. Иондық күш жеткілікті деңгейге жеткенде белок ерітіндіден тұнбаға түседі, бұл эффект "тұздан шығару" деп аталады. Аммоний (NH4+) және сульфат (SO42-) иондары сулы ерітіндіде болғанда, олар тазартылатын қосылыстағы қарама-қарсы зарядтарға тартылады. Қарама-қарсы зарядтардың тартылуы су молекулаларының тазартылатын қосылыспен өзара әрекеттесуіне кедері келтіреді, нәтижесінде тұнбаға түсу немесе "тұздандыру" процесі жүзеге асады. Тұздандыру механизмінде су қабатынан тұздың шығарылуы жүреді, бұл қабат белоктың бетімен тығыз байланысты және гидратациялық қабат деп аталады. Гидратациялық қабат ерігіштікті сақтауда және белоктың дұрыс табиғи конформациясын қолдауда маңызды рөл атқарады. Белок пен су арасында үш негізгі өзара әрекеттесу бар: зарядталған бүйір тізбектер арасындағы иондық гидратация, полярлық топтар мен су арасындағы сутектік байланыс және гидрофобтық гидратация. Тұз қосылғанда судың беттік кернеуі артады, соның салдарынан су мен қызығушылық тудыратын белок арасындағы гидрофобтық өзара әрекеттесу күшейеді. Қызығушылық тудыратын белок өзінің беттік ауданын азайтады, бұл оның еріткішпен байланысын азайтады. Бұл белоктың бүктелуі мен өзін-өзі біріктіруі арқылы көрінеді, бұл соңында тұнбаға түсуге әкеледі. Белоктың бүктелуі мен өзін-өзі біріктіруі еркін суды шығарады, энтропияның артуына себеп болады және бұл процесті энергетикалық тұрғыдан тиімді етеді. Қатты аммоний сульфатын тікелей қосу ерітіндінің pH-ын өзгертеді, бұл ферменттік белсенділіктің жоғалуына әкелуі мүмкін. Мұндай жағдайларда, қатты аммоний сульфатын қосудың орнына, қолайлы буферде қаныққан аммоний сульфатын қосу қолданылады. Екі тәсілдің де нәтижесінде алынған белок тұнбасын стандартты буферде ерітіп, жалпы белок мөлшерін анықтау үшін талдауға болады. Қосылған аммоний сульфатының концентрациясы қызығушылық тудыратын белоктың көп бөлігін тұнбаға түсіретіндей, ал белок ластаушыларының максималды мөлшерін ерітіндіде қалдыратын мәнге дейін арттырылуы керек. Тұнбаға түскен қызығушылық тудыратын белокты центрифугалау арқылы қайта алып, келесі тазарту кезеңіне дайындау үшін стандартты буферде ерітуге болады. Тазартудың келесі кезеңінде белоктан қосылған тұздың бәрін жою қажет. Мұны диализ арқылы жасауға болады, бірақ диализ концентрацияланған белокты одан әрі сұйылтады. Аммоний сульфатын белоктан жоюдың тиімді тәсілі – тұнба белокты SDS, Tris HCl және фенол қоспасы бар буферде араластырып, қоспаны центрифугалау. Бұл центрифугалаудан алынған тұнбада азырақ тұз концентрациясы бар белок болады.

Ammonium sulfate, as well as other neutral salts, will stabilize proteins by preferential solvation. Proteins are usually stored in ammonium sulfate because it inhibits bacterial growth. With the addition of ammonium sulfate, proteins unfolded by denaturants can be pushed into their native conformations. This can be seen with the folding of recombinant proteins. The solubility of proteins varies according to the ionic strength of the solution, thus according to the salt concentration. At low ion concentrations (less than 0.5 mol/L), the solubility of proteins increases with increasing salt concentration, an effect termed "salting in". As the salt concentration is further increased, the solubility of the protein begins to decrease. At a sufficiently high ionic strength, the protein will precipitate out of the solution, an effect termed "salting out". When the ammonium (NH4+) and sulfate (SO42 ) ions are within the aqueous solution they are attracted to the opposite charges evident on the compound that is being purified. This attraction of opposite charges prevents the water molecules from interacting with the compound being purified, leading to the precipitation or "salting out". With the mechanism of salting out, there is an omission of the salt from the layer of water, which is closely associated with the surface of the protein, known as the hydration layer. The hydration layer plays a vital role in sustaining solubility and suitable natural conformation. There are three main protein water interaction: ion hydration between charged side chains, hydrogen bonding between polar groups and water, and hydrophobic hydration. Once salt is added to the mixture, there is an increase in the surface tension of the water, thus increasing hydrophobic interactions between water and the protein of interest. The protein of interest then reduces its surface area, which diminishes its contact with the solvent. This is shown by the folding and self association, which ultimately leads to precipitation. The folding and self association of the protein pushes out free water, leading to an increase in entropy and making this process energetically favorable. The direct addition of solid ammonium sulfate does change the pH of the solution, which can lead to loss of enzyme activity. In those cases, the addition of saturated ammonium sulfate in a suitable buffer is used as an alternative to adding solid ammonium sulfate. In either approach, the resulting protein precipitate can be dissolved individually in a standard buffer and assayed to determine the total protein content. The ammonium sulfate concentration added should be increased to a value that will precipitate most of the protein of interest whilst leaving the maximum amount of protein contaminants still in the solution. The precipitated protein of interest can subsequently be recovered by centrifugation and dissolved in standard buffer to prepare the sample for the next stage of purification. In the next stage of purification, all this added salt needs to be removed from the protein. One way to do so is using dialysis, but dialysis further dilutes the concentrated protein. The better way of removing ammonium sulfate from the protein is mixing the precipitate protein in a buffer containing a mixture of SDS, Tris HCl, and phenol and centrifuging the mixture. The precipitate that comes out of this centrifugation will contain salt less concentrated protein.

Қолданбалар

Аммиак сульфатының тұнбалануы ақуызды тазартудың бастапқы қадамы ретінде тиімді техника болып табылады, себебі ол жасушалық ақуыздарды жылдам және көп көлемде тұнбалауға мүмкіндік береді. Бұл әдіс көбінесе тазартудың кейінгі кезеңдерінде де қолданылады, мысалы, гель сүзгісі сияқты процедуралардан кейін ақуызды сұйытылған ерітіндіден шоғырландыру үшін. Алайда, бұл әдістің кемшілігі – ақуызбен бірге басқа да заттар тұнбаланып қалуы мүмкін, сондықтан иондық хроматография немесе молекулалық масса бойынша бөліп тазарту сияқты қосымша тазарту техникаларын қолдану қажет.