Интерлейкин-2: регуляция иммунного ответа и экспрессия гена.

Введение

Белки млекопитающих, обнаруженные у Homo sapiens. Интерлейкин 2 (IL 2) является интерлейкином, типом цитокиновой сигнальной молекулы в иммунной системе. Это белок массой 15,5–16 кДа, который регулирует активность лейкоцитов (часто лимфоцитов), ответственных за иммунитет. IL 2 является частью естественного ответа организма на микробную инфекцию и на разграничение между чужеродными («не-само») и «собственными» антигенами. IL 2 реализует свои эффекты посредством связывания с IL 2-рецепторами, экспрессируемыми лимфоцитами. Основными источниками IL 2 являются активированные CD4+ Т-клетки и активированные CD8+ Т-клетки. α-субъединица IL 2-рецептора (IL 2R) связывает IL 2 с низкой аффинностью (Kd ~ 10−8 M). Взаимодействие IL 2 и CD25 само по себе не приводит к трансдукции сигнала из-за короткой внутриклеточной цепи, но обладает способностью (при связывании с β- и γ-субъединицами) увеличить аффинность IL 2R в 100 раз. IL 2 может передавать сигнал либо через димерный IL 2R CD122/CD132 с промежуточной аффинностью (Kd ~ 10−9 M), либо через тримерный CD25/CD122/CD132 IL 2R с высокой аффинностью (Kd ~ 10−11 M) с сигналом «экспрессия других белков». Белки, экспрессируемые посредством этих трех путей, включают bcl 6 (путь PI3K/Akt/mTOR), CD25 и prdm 1 (путь JAK STAT) и определенные циклины (путь MAPK/ERK). Регуляция экспрессии гена IL 2 может осуществляться на нескольких уровнях или различными способами. Одним из контрольных пунктов (то есть одним из условий, необходимых для экспрессии IL 2) является передача сигнала посредством взаимодействия Т-клеточного рецептора (TCR) и комплекса HLA-пептида. В результате этого взаимодействия запускается сигнальный путь (активирующий клеточный аппарат для синтеза или «производства» IL 2), зависимый от фосфолипазы C (PLC). PLC активирует 3 основных фактора транскрипции и их пути: NFAT, NFkB и AP 1. Кроме того, после костимуляции CD28 индуцируется оптимальная активация экспрессии IL 2 и этих путей. Таким образом, прежде чем клетка начнет синтезировать IL 2 в соответствии с этим путем, должны произойти две реакции: взаимодействие TCR+HLA и белкового комплекса, с одной стороны, и костимуляция CD28, с другой. Сама по себе лигация IL 2 к его рецептору имеет слишком низкую аффинность для активации этого пути. Одновременно экспрессируется Oct 1, что способствует активации. Oct1 экспрессируется в Т-лимфоцитах, а Oct2 индуцируется после активации клеток. NFAT имеет несколько членов семейства, все они локализованы в цитоплазме, а сигнализация проходит через кальцинеурин, в результате чего NFAT дефосфорилируется и транслоцируется в ядро. AP 1 является димером и состоит из белков c Jun и c Fos. Он взаимодействует с другими факторами транскрипции, включая NFkB и Oct. NFkB транслоцируется в ядро после костимуляции через CD28. NFkB является гетеродимером и содержит два сайта связывания на промоторе IL 2.

Mammalian protein found in Homo sapiens

Interleukin 2 (IL 2) is an interleukin, a type of cytokine signaling molecule in the immune system. It is a 15.5–16 kDa protein that regulates the activities of white blood cells (leukocytes, often lymphocytes) that are responsible for immunity. IL 2 is part of the body's natural response to microbial infection, and in discriminating between foreign ("non self") and "self". IL 2 mediates its effects by binding to IL 2 receptors, which are expressed by lymphocytes. The major sources of IL 2 are activated CD4+ T cells and activated CD8+ T cells. The IL 2 receptor (IL 2R) α subunit binds IL 2 with low affinity (Kd~ 10−8 M). Interaction of IL 2 and CD25 alone does not lead to signal transduction due to its short intracellular chain but has the ability (when bound to the β and γ subunit) to increase the IL 2R affinity 100 fold. IL 2 can signalize either via intermediate affinity dimeric CD122/CD132 IL 2R (Kd~ 10−9 M) or high affinity trimeric CD25/CD122/CD132 IL 2R (Kd~ 10−11 M). with an "express other proteins" signal. The proteins expressed by means of the three pathways include bcl 6 (the PI3K/Akt/mTOR pathway), CD25 & prdm 1 (the JAK STAT pathway) and certain cyclins (the MAPK/ERK pathway). Gene expression regulation for IL 2 can be on multiple levels or by different ways. One of the checkpoints (in other words one of the things which needs to be done before IL 2 is expressed) is that there must be signaling through a conjunction of a T Cell Receptor (a TCR) and an HLA peptide complex. As a result of that conjunction a signalling pathway (signalling a cell's protein making machinery to express or 'make' IL 2), a PhosphoLipase C (PLC) dependent pathway, is set up. PLC activates 3 major transcription factors and their pathways: NFAT, NFkB and AP 1. In addition and after costimulation from CD28 the optimal activation of expression of IL 2 and these pathways is induced. In summary therefore before a cell will make IL 2 in accordance with this pathway there have to be two reactions: TCR+HLA and protein complex on the one hand and CD28 costimulation on the other indeed mere IL 2 ligation to its receptor is too low affinity to enable pathway. At the same time Oct 1 is expressed. It helps the activation. Oct1 is expressed in T lymphocytes and Oct2 is induced after cell activation. NFAT has multiple family members, all of them are located in cytoplasm and signaling goes through calcineurin, NFAT is dephosphorylated and therefore translocated to the nucleus. AP 1 is a dimer and is composed of c Jun and c Fos proteins. It cooperates with other transcription factors including NFkB and Oct.

NFkB is translocated to the nucleus after costimulation through CD28. NFkB is a heterodimer and there are two binding sites on the IL 2 promoter.

Функция

IL-2 играет важную роль в ключевых функциях иммунной системы, толерантности и иммунитета, главным образом посредством прямого воздействия на Т-клетки. В тимусе, где происходит созревание Т-клеток, он предотвращает развитие аутоиммунных заболеваний, стимулируя дифференцировку определенных незрелых Т-клеток в регуляторные Т-клетки, которые подавляют другие Т-клетки, склонные к атаке на нормальные здоровые клетки организма. IL-2 усиливает активационно-индуцированную клеточную гибель (AICD). IL-2 повышает цитотоксическую активность как естественных киллеров, так и цитотоксических Т-клеток.

Эволюция

IL-2 обнаружен во всех классах челюстноротых позвоночных, включая акул, в сходном геномном локусе. У рыб IL-2 использует общую альфа-цепь рецептора с родственными цитокинами IL-15 и IL-15-подобным (IL-15L). Эта рецепторная цепь "IL-15Rα" аналогична IL-15Rα у млекопитающих, и в ходе эволюции тетрапод дупликация кодирующего гена и последующая диверсификация привели к формированию IL-2Rα у млекопитающих. Анализ последовательностей и структуры IL-2 у травяного карпа позволяет предположить, что рыбный IL-2 связывается с IL-15Rα подобно тому, как IL-15 у млекопитающих связывается с IL-15Rα. Несмотря на то, что рыбные IL-2 и IL-15 используют одну и ту же цепь IL-15Rα, стабильность рыбного IL-2 не зависит от нее, тогда как IL-15 и особенно IL-15L нуждаются в связывании с (ко-презентации с) IL-15Rα для обеспечения своей стабильности и функционирования. Помимо этой петли отрицательной обратной связи, IL-2 млекопитающих также участвует в петле положительной обратной связи, поскольку активированные T-клетки усиливают собственную экспрессию IL-2Rα и, по-видимому, преимущественно стимулируют регуляторные T-клетки. Рыбный IL-2 индуцирует экспрессию цитокинов как Th1, так и Th2 типов иммунитета. Как показали некоторые исследования IL-2 у млекопитающих, данные указывают на то, что рыбный IL-2 способен образовывать гомодимеры, и это является древним свойством цитокинов семейства IL-2/15/15L.

Фармацевтические аналоги

Альдеслеукин является формой рекомбинантного интерлейкина-2. Он производится с использованием технологии рекомбинантной ДНК и продается в качестве белкового терапевтического препарата под торговой маркой Proleukin. Он был одобрен Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (FDA) с предупреждением в черной рамке, а также в ряде европейских стран для лечения онкологических заболеваний (злокачественной меланомы, рака почечных клеток) в больших, прерывистых дозах и широко применяется в виде непрерывных доз. Неолеукин 2/15 – это компьютерно спроектированный аналог интерлейкина-2, разработанный для снижения частоты распространенных побочных эффектов. Однако клинические испытания данного препарата были остановлены.

Дозировка

В США и во всем мире применяются различные дозы ИЛ-2. Эффективность и побочные эффекты разных дозировок часто вызывают споры. Коммерческий интерес к местной терапии ИЛ-2 остается крайне низким. Поскольку используется очень низкая доза ИЛ-2, стоимость лечения одного пациента составляет около 500 долларов США – это коммерческая стоимость запатентованного ИЛ-2. Коммерческая отдача от инвестиций слишком мала, чтобы стимулировать проведение дополнительных клинических исследований для регистрации внутриопухолевой терапии ИЛ-2.

Соединенные Штаты

Обычно в США используется более высокая доза, зависящая от типа рака, ответа на лечение и общего состояния здоровья пациента. Пациентов обычно лечат в течение пяти дней подряд, три раза в день, по пятнадцать минут. Последующие примерно 10 дней позволяют пациенту восстановиться между курсами лечения. IL-2 вводится внутривенно в стационаре для обеспечения надлежащего мониторинга побочных эффектов. Схема с более низкой дозой предполагает подкожные инъекции IL-2, как правило, в амбулаторных условиях. В качестве альтернативы, препарат может быть введен в стационар в течение 1–3 дней, аналогично и часто в сочетании с химиотерапией.

Местное применение

В доклинических и ранних клинических исследованиях было показано, что локальное введение IL-2 в опухоль клинически более эффективно в противораковой терапии, чем системная терапия IL-2, в широком диапазоне доз, без серьезных побочных эффектов. Опухолевые кровеносные сосуды более уязвимы к действию IL-2, чем нормальные кровеносные сосуды. При инъекции непосредственно в опухоль, то есть при локальном введении, в опухолевой ткани происходит процесс, механически схожий с синдромом сосудистой проницаемости. Нарушение кровотока внутри опухоли эффективно разрушает опухолевую ткань. При локальном введении системная доза IL-2 слишком низка, чтобы вызывать побочные эффекты, поскольку общая доза примерно в 100–1000 раз меньше. Клинические исследования показали, что наиболее значимым побочным эффектом, о котором сообщали пациенты, были болезненные инъекции в области облучения. В случае облучения карциномы носоглотки пятилетняя выживаемость без признаков заболевания увеличилась с 8% до 63% при локальной терапии IL-2.

Токсичность

Системный IL-2 имеет узкое терапевтическое окно, и степень дозирования обычно определяет тяжесть побочных эффектов. В случае локального применения IL-2 терапевтическое окно простирается на несколько порядков величины. Другими недостатками иммунотерапии IL-2 являются его короткий период полувыведения в кровообращении и способность преимущественно расширять регуляторные Т-клетки при высоких дозах. Этот препарат связывается с IL-2 рецепторами и вводит дифтерийный токсин в клетки, экспрессирующие эти рецепторы, вызывая их гибель. При некоторых лейкемиях и лимфомах злокачественные клетки экспрессируют IL-2 рецептор, поэтому денилеукин дифтитокс может их уничтожать. В 1999 году препарат Ontak был одобрен Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (FDA) для лечения кожной Т-клеточной лимфомы (CTCL).

Доклинические исследования

IL-2 не следует классической кривой «доза-ответ» для химиотерапевтических препаратов. Иммунологическая активность высоких и низких доз IL-2 резко различается. Это может быть связано с различным распределением рецепторов IL-2 (CD25, CD122, CD132) на разных клеточных популяциях, что приводит к активации различных клеток при высоких и низких дозах IL-2. В целом, высокие дозы оказывают иммуносупрессивное действие, в то время как низкие дозы могут стимулировать иммунитет 1 типа. Сообщалось, что низкие дозы IL-2 снижают выраженность инфекций, вызванных вирусами гепатита C и B. IL-2 использовался в клинических исследованиях для лечения хронических вирусных инфекций, а также в качестве усилителя (адъюванта) для вакцин. В двух крупных клинических испытаниях, опубликованных в 2009 году, было показано, что применение высоких доз IL-2 с интервалом в 6–8 недель в терапии ВИЧ, аналогично его применению в онкологии, оказалось неэффективным в предотвращении прогрессирования заболевания до стадии СПИДа. В последнее время низкие дозы IL-2 продемонстрировали перспективные результаты в модуляции иммунной системы при таких заболеваниях, как сахарный диабет 1 типа и васкулит. Также проводятся многообещающие исследования по применению низких доз IL-2 при ишемической болезни сердца.

Имунокомплексы IL-2/анти-IL-2 mAb (IL-2 ic)

IL 2 не может реализовать свою роль перспективного иммунотерапевтического агента из-за значительных недостатков, перечисленных выше. Некоторые из этих проблем можно преодолеть, используя IL 2 ic. Они состоят из IL 2 и некоторых его моноклональных антител (mAb) и способны усиливать биологическую активность IL 2 in vivo. Основной механизм этого явления in vivo заключается в увеличении периода полувыведения цитокина в кровообращении. В зависимости от клона IL 2 mAb, IL 2 ic может избирательно стимулировать либо CD25high клетки (комплексы IL 2/JES6 1), либо CD122high клетки (IL 2/S4B6). Иммунные комплексы IL 2/S4B6 обладают высокой стимулирующей активностью в отношении NK-клеток и CD8+ Т-клеток памяти и, таким образом, могут заменить традиционный IL 2 в иммунотерапии рака. С другой стороны, IL 2/JES6 1 высокоселективно стимулируют регуляторные Т-клетки и могут быть потенциально полезны при трансплантации и лечении аутоиммунных заболеваний. В середине 1970-х годов было обнаружено, что Т-клетки могут селективно пролиферировать при культивировании нормальных клеток костного мозга человека в кондиционированной среде, полученной из стимулированных фитогемагглютинином нормальных человеческих лимфоцитов. Ключевой фактор был выделен из культивируемых мышиных клеток в 1979 году и из культивируемых человеческих клеток в 1980 году. Ген, кодирующий человеческий IL 2, был клонирован в 1982 году после острой конкуренции. Коммерческая деятельность по выводу препарата IL 2 на рынок была интенсивной в 1980-х и 1990-х годах. К 1983 году компания Cetus Corporation создала запатентованную рекомбинантную версию IL 2 (альдеслеукин, позднее получившую торговое название Пролеукин), с удаленным аланином из N-конца и заменой остатка 125 на серин. Неудача привела к банкротству Cetus, и в 1991 году компания была продана Chiron Corporation. Chiron продолжила разработку IL 2, который, наконец, был одобрен FDA под названием Пролеукин для лечения метастатической почечной карциномы в 1992 году. К 1993 году альдеслеукин был единственной одобренной версией IL 2, но Roche также разрабатывала запатентованный, модифицированный, рекомбинантный IL 2 под названием тецелеукин, с добавленным метионином в N-конец, а Glaxo разрабатывала версию под названием биолеукин, с добавленным метионином в N-конец и заменой остатка 125 на аланин. Были проведены десятки клинических испытаний рекомбинантного или очищенного IL 2, как в монотерапии, так и в комбинации с другими препаратами, или с использованием клеточной терапии, при которой клетки извлекались у пациентов, активировались IL 2, а затем возвращались в организм. Novartis приобрела Chiron в 2006 году и передала лицензию на бизнес по производству альдеслеукина в США компании Prometheus Laboratories в 2010 году, прежде чем глобальные права на Пролеукин были впоследствии приобретены Clinigen в 2018 и 2019 годах.

IL 2 cannot accomplish its role as a promising immunotherapeutic agent due to significant drawbacks which are listed above. Some of the issues can be overcome using IL 2 ic. They are composed of IL 2 and some of its monoclonal antibody (mAb) and can potentiate biologic activity of IL 2 in vivo. The main mechanism of this phenomenon in vivo is due to the prolongation of the cytokine half life in circulation. Depending on the clone of IL 2 mAb, IL 2 ic can selectively stimulate either CD25high (IL 2/JES6 1 complexes), or CD122high cells (IL 2/S4B6). IL 2/S4B6 immune complexes have high stimulatory activity for NK cells and memory CD8+ T cells and they could thus replace the conventional IL 2 in cancer immunotherapy. On the other hand, IL 2/JES6 1 highly selectively stimulate regulatory T cells and they could be potentially useful for transplantations and in treatment of autoimmune diseases. In the mid 1970s, it was discovered that T cells could be selectively proliferated when normal human bone marrow cells were cultured in conditioned medium obtained from phytohemagglutinin stimulated normal human lymphocytes. The key factor was isolated from cultured mouse cells in 1979 and from cultured human cells in 1980. The gene for human IL 2 was cloned in 1982 after an intense competition. Commercial activity to bring an IL 2 drug to market was intense in the 1980s and '90s. By 1983, Cetus Corporation had created a proprietary recombinant version of IL 2 (Aldesleukin, later branded as Proleukin), with the alanine removed from its N terminal and residue 125 replaced with serine. The failure led to the collapse of Cetus, and in 1991 the company was sold to Chiron Corporation. Chiron continued the development of IL 2, which was finally approved by the FDA as Proleukin for metastatic renal carcinoma in 1992. By 1993 aldesleukin was the only approved version of IL 2, but Roche was also developing a proprietary, modified, recombinant IL 2 called teceleukin, with a methionine added at is N terminal, and Glaxo was developing a version called bioleukin, with a methionine added at is N terminal and residue 125 replaced with alanine. Dozens of clinical trials had been conducted of recombinant or purified IL 2, alone, in combination with other drugs, or using cell therapies, in which cells were taken from patients, activated with IL 2, then reinfused. Novartis acquired Chiron in 2006 and licensed the US aldesleukin business to Prometheus Laboratories in 2010 before global rights to Proleukin were subsequently acquired by Clinigen in 2018 and 2019.