Введение
Пиросеквенирование – это метод секвенирования ДНК (определение порядка нуклеотидов в ДНК), основанный на принципе «секвенирования путем синтеза», в котором секвенирование выполняется путем обнаружения нуклеотида, включенного ДНК-полимеразой. Пиросеквенирование основывается на детекции света, возникающей в результате цепной реакции при высвобождении пирофосфата, что и обусловило название метода. Принцип пиросеквенирования был впервые описан в 1993 году Бертилем Петтерссоном, Матиасом Уленом и Полом Найреном путем объединения метода секвенирования в твердой фазе с использованием магнитных частиц, покрытых стрептавидином, с рекомбинантной ДНК-полимеразой, лишенной 3´–5´экзонуклеазной активности (корректирующей функции), и детекции люминесценции с использованием фермента люциферазы светлячков. К одноцепочечной ДНК, подлежащей секвенированию, добавляют смесь из трех ферментов (ДНК-полимеразы, АТФ-сульфурилазы и люциферазы светлячков) и нуклеотида (dNTP), а включение нуклеотида отслеживают, измеряя интенсивность испускаемого света. Интенсивность света определяет, было ли включено 0, 1 или более нуклеотидов, тем самым показывая, сколько комплементарных нуклеотидов присутствует на матричной цепи. Нуклеотидная смесь удаляется перед добавлением следующей. Этот процесс повторяется с каждым из четырех нуклеотидов до тех пор, пока не будет определена последовательность ДНК одноцепочечного шаблона. Второй, растворный метод пиросеквенирования был описан в 1998 году Мостафой Ронаги, Матиасом Уленом и Полом Найреном. В этом альтернативном методе был введен дополнительный фермент апираза для удаления нуклеотидов, не включенных ДНК-полимеразой. Это позволило добавлять смесь ферментов, включающую ДНК-полимеразу, люциферазу и апиразу, в начале процедуры и поддерживать ее на протяжении всего процесса, обеспечивая тем самым простую настройку, подходящую для автоматизации. На следующий год компания Pyrosequencing представила на рынок автоматизированный прибор, основанный на этом принципе. Третий, микрофлюидный вариант метода пиросеквенирования был описан в 2005 году Джонатаном Ротбергом и его коллегами из компании 454 Life Sciences. Этот альтернативный подход к пиросеквенированию основывался на первоначальном принципе присоединения ДНК, подлежащей секвенированию, к твердому носителю, и они показали, что секвенирование может быть выполнено в высокопараллельном режиме с использованием микрофабрикованного микромассива. Это позволило проводить высокопроизводительное секвенирование ДНК, и на рынок был выпущен автоматизированный прибор. Он стал первым инструментом секвенирования нового поколения, открыв новую эру в геномных исследованиях, с быстро снижающимися ценами на секвенирование ДНК, что сделало возможным секвенирование геномов по доступным ценам.
Pyrosequencing is a method of DNA sequencing (determining the order of nucleotides in DNA) based on the "sequencing by synthesis" principle, in which the sequencing is performed by detecting the nucleotide incorporated by a DNA polymerase. Pyrosequencing relies on light detection based on a chain reaction when pyrophosphate is released. Hence, the name pyrosequencing. The principle of pyrosequencing was first described in 1993 by, Bertil Pettersson, Mathias Uhlen and Pål Nyren by combining the solid phase sequencing method using streptavidin coated magnetic beads with recombinant DNA polymerase lacking 3´to 5´exonuclease activity (proof reading) and luminescence detection using the firefly luciferase enzyme. A mixture of three enzymes (DNA polymerase, ATP sulfurylase and firefly luciferase) and a nucleotide (dNTP) are added to single stranded DNA to be sequenced and the incorporation of nucleotide is followed by measuring the light emitted. The intensity of the light determines if 0, 1 or more nucleotides have been incorporated, thus showing how many complementary nucleotides are present on the template strand. The nucleotide mixture is removed before the next nucleotide mixture is added. This process is repeated with each of the four nucleotides until the DNA sequence of the single stranded template is determined. A second solution based method for pyrosequencing was described in 1998 by Mostafa Ronaghi, Mathias Uhlen and Pål Nyren. In this alternative method, an additional enzyme apyrase is introduced to remove nucleotides that are not incorporated by the DNA polymerase. This enabled the enzyme mixture including the DNA polymerase, the luciferase and the apyrase to be added at the start and kept throughout the procedure, thus providing a simple set up suitable for automation. An automated instrument based on this principle was introduced to the market the following year by the company Pyrosequencing. A third microfluidic variant of the pyrosequencing method was described in 2005 by Jonathan Rothberg and co workers at the company 454 Life Sciences. This alternative approach for pyrosequencing was based on the original principle of attaching the DNA to be sequenced to a solid support and they showed that sequencing could be performed in a highly parallel manner using a microfabricated microarray. This allowed for high throughput DNA sequencing and an automated instrument was introduced to the market. This became the first next generation sequencing instrument starting a new era in genomics research, with rapidly falling prices for DNA sequencing allowing whole genome sequencing at affordable prices.
Ограничения
В настоящее время ограничением метода является то, что длины отдельных ридов ДНК-последовательности составляют приблизительно 300–500 нуклеотидов, что меньше, чем 800–1000, достигаемых методами секвенирования по прекращению цепи (например, секвенированием Сангера). Это может затруднить процесс сборки генома, особенно для последовательностей, содержащих большое количество повторов. Отсутствие коррекции ошибок ограничивает точность данного метода.
Коммерциализация
Компания Pyrosequencing AB в Уппсале, Швеция, была основана с использованием венчурного капитала, предоставленного HealthCap, для коммерциализации оборудования и реагентов для секвенирования коротких фрагментов ДНК с помощью технологии пиросеквенирования. Pyrosequencing AB была котирована на Стокгольмской фондовой бирже в 1999 году. В 2003 году компания была переименована в Biotage. В 2008 году Qiagen приобрела направление бизнеса пиросеквенирования. Технология пиросеквенирования была дополнительно лицензирована компании 454 Life Sciences. 454 разработала платформу пиросеквенирования на основе матриц, которая стала платформой для крупномасштабного секвенирования ДНК, включая секвенирование геномов и метагеномику. В 2013 году компания Roche объявила о прекращении поддержки платформы секвенирования 454.