Экспрессированные последовательности тегов (EST): обзор и применение.

Введение

В генетике экспрессированный тег последовательности (EST) – это короткая подпоследовательность последовательности кДНК. ЭСТ могут использоваться для идентификации транскриптов генов и сыграли важную роль в открытии генов и определении их последовательности. Идентификация ЭСТ происходила быстро, и на данный момент в общедоступных базах данных (например, GenBank на 1 января 2013 года, все виды) доступно около 74,2 миллиона ЭСТ. Методы, основанные на ЭСТ, в значительной степени уступили место секвенированию целого генома и транскриптома, а также секвенированию метагенома. ЭСТ является результатом однократного секвенирования клонированной кДНК. кДНК, используемые для генерации ЭСТ, обычно представляют собой отдельные клоны из библиотеки кДНК. Полученная последовательность – это относительно низкокачественный фрагмент, длина которого ограничена современными технологиями примерно 500–800 нуклеотидами. Поскольку эти клоны состоят из ДНК, комплементарной мРНК, ЭСТ представляют собой участки экспрессируемых генов. В базах данных они могут быть представлены как последовательность кДНК/мРНК или как обратный комплемент мРНК – матричная цепь. ЭСТ можно сопоставить с конкретными участками хромосом, используя методы физического картирования, такие как картирование радиационных гибридов, HAPPY-картирование или FISH. В качестве альтернативы, если геном организма, из которого получен ЭСТ, был секвенирован, последовательность ЭСТ можно выровнять с этим геномом с помощью компьютера. Современное понимание набора генов человека включает существование тысяч генов, идентифицированных исключительно на основании данных ЭСТ. В связи с этим ЭСТ стали инструментом для уточнения предсказанных транскриптов этих генов, что приводит к прогнозированию их белковых продуктов и, в конечном итоге, их функции. Более того, условия, в которых были получены эти ЭСТ (ткань, орган, состояние заболевания, например, рак), предоставляют информацию об условиях, в которых действует соответствующий ген. ЭСТ содержат достаточно информации для разработки точных зондов для ДНК-микромассивов, которые затем можно использовать для определения профилей экспрессии генов. Некоторые авторы используют термин «ЭСТ» для описания генов, для которых, помимо тега, существует мало или совсем нет дополнительной информации.

In genetics, an expressed sequence tag (EST) is a short sub sequence of a cDNA sequence. ESTs may be used to identify gene transcripts, and were instrumental in gene discovery and in gene sequence determination. The identification of ESTs has proceeded rapidly, with approximately 74.2 million ESTs now available in public databases (e. g. GenBank 1 January 2013, all species). EST approaches have largely been superseded by whole genome and transcriptome sequencing and metagenome sequencing. An EST results from one shot sequencing of a cloned cDNA. The cDNAs used for EST generation are typically individual clones from a cDNA library. The resulting sequence is a relatively low quality fragment whose length is limited by current technology to approximately 500 to 800 nucleotides. Because these clones consist of DNA that is complementary to mRNA, the ESTs represent portions of expressed genes. They may be represented in databases as either cDNA/mRNA sequence or as the reverse complement of the mRNA, the template strand. One can map ESTs to specific chromosome locations using physical mapping techniques, such as radiation hybrid mapping, HAPPY mapping, or FISH. Alternatively, if the genome of the organism that originated the EST has been sequenced, one can align the EST sequence to that genome using a computer. The current understanding of the human set of genes includes the existence of thousands of genes based solely on EST evidence. In this respect, ESTs have become a tool to refine the predicted transcripts for those genes, which leads to the prediction of their protein products and ultimately of their function. Moreover, the situation in which those ESTs are obtained (tissue, organ, disease state e. g. cancer) gives information on the conditions in which the corresponding gene is acting. ESTs contain enough information to permit the design of precise probes for DNA microarrays that then can be used to determine gene expression profiles. Some authors use the term "EST" to describe genes for which little or no further information exists besides the tag.

История

В 1979 году группы из Гарварда и Калтеха расширили основную идею получения копий ДНК мРНК in vitro до амплификации библиотеки таких копий в бактериальных плазмидах. В 1982 году Грег Сатклифф и его коллеги исследовали возможность отбора случайных или полуслучайных клонов из такой кДНК-библиотеки для секвенирования. В 1983 году Putney и соавторы секвенировали 178 клонов из кДНК-библиотеки кроличьих мышечных тканей. В 1991 году Адамс и его коллеги ввели термин EST и инициировали более систематическое секвенирование в рамках проекта (начиная с 600 кДНК мозга). Unigene и STACK.

Построение EST-контигов – непростая задача и может приводить к артефактам (контигам, содержащим продукты двух различных генов). Когда полная последовательность генома организма известна и транскрипты аннотированы, можно избежать сборки контигов и напрямую сопоставлять транскрипты с EST. Этот подход используется в системе TissueInfo (см. ниже) и позволяет легко связывать аннотации в геномной базе данных с информацией о тканях, полученной на основе данных EST.

Информация о тканях

Анализ высокопроизводительных ЭСТ часто сталкивается с аналогичными проблемами управления данными. Первая проблема заключается в том, что происхождение тканей в библиотеках EST описано обычным английским языком в dbEST. Это затрудняет написание программ, которые могут однозначно определить, что две библиотеки EST были секвенированы из одной и той же ткани. Аналогично, информация о патологических состояниях ткани не представлена в формате, удобном для машинной обработки. Например, информация о раковой природе библиотеки часто объединена с названием ткани (например, название ткани "глиобластома" указывает, что библиотека EST была секвенирована из ткани мозга, а патологическое состояние – рак). За исключением случаев рака, информация о заболевании часто отсутствует в записях dbEST. Проект TissueInfo был начат в 2000 году для решения этих проблем. Проект предоставляет курированные данные (обновляемые ежедневно) для уточнения происхождения ткани и статуса заболевания (рак/не рак), предлагает онтологию тканей, которая связывает ткани и органы отношениями "является частью" (то есть формализует знания о том, что гипоталамус является частью мозга, а мозг – частью центральной нервной системы), и распространяет программное обеспечение с открытым исходным кодом для связи аннотаций транскриптов из секвенированных геномов с профилями экспрессии тканей, рассчитанными на основе данных в dbEST.