Определение и методы секвенирования ДНК

Введение

В генетике и биохимии определение структуры неразветвленного биополимера – это генетическое определение "секвенирования".

В генетике и биохимии секвенирование означает определение первичной структуры (иногда ошибочно называемой первичной последовательностью) неразветвленного биополимера. Результатом секвенирования является символическое линейное представление, известное как последовательность, которое кратко суммирует значительную часть атомной структуры секвенированной молекулы.

Секвенирование ДНК

Секвенирование ДНК — это процесс определения последовательности нуклеотидов в данном фрагменте ДНК. До настоящего времени большинство секвенирований ДНК выполнялось с использованием метода обрыва цепи, разработанного Фредериком Сэнгером. Эта методика использует специфическое прерывание реакции синтеза ДНК с помощью модифицированных нуклеотидных субстратов. Однако новые технологии секвенирования, такие как пиросеквенирование, завоевывают все большую долю рынка. В настоящее время пиросеквенирование генерирует больше геномных данных, чем секвенирование ДНК по Сэнгеру. Пиросеквенирование сделало возможным быстрое секвенирование геномов. Геномы бактерий могут быть секвенированы за один проход с многократным покрытием с использованием этой методики. Недавно этот метод также был использован для секвенирования генома Джеймса Уотсона. Последовательность ДНК кодирует необходимую информацию для выживания и размножения живых организмов. Поэтому определение последовательности полезно как в фундаментальных исследованиях, направленных на понимание того, почему и как живут организмы, так и в прикладных областях. В силу ключевой важности ДНК для живых существ, знание последовательностей ДНК полезно практически в любой области биологических исследований. Например, в медицине это может быть использовано для выявления, диагностики и потенциальной разработки методов лечения генетических заболеваний. Аналогично, исследования патогенов могут привести к разработке методов лечения инфекционных заболеваний. Биотехнология — это стремительно развивающаяся дисциплина, обладающая потенциалом для создания множества полезных продуктов и услуг. «Кривая Карлсона» — термин, введенный журналом The Economist для описания биотехнологического эквивалента закона Мура, названного в честь автора Роба Карлсона. Карлсон точно предсказал, что время удвоения технологий секвенирования ДНК (измеряемое по стоимости и производительности) будет не медленнее, чем по закону Мура. Кривые Карлсона иллюстрируют быстрое (в некоторых случаях гиперэкспоненциальное) снижение стоимости и увеличение производительности различных технологий, включая секвенирование ДНК, синтез ДНК, а также ряд физических и вычислительных инструментов, используемых в экспрессии белков и определении их структуры.

DNA sequencing is the process of determining the nucleotide order of a given DNA fragment. So far, most DNA sequencing has been performed using the chain termination method developed by Frederick Sanger. This technique uses sequence specific termination of a DNA synthesis reaction using modified nucleotide substrates. However, new sequencing technologies such as pyrosequencing are gaining an increasing share of the sequencing market. More genome data are now being produced by pyrosequencing than Sanger DNA sequencing. Pyrosequencing has enabled rapid genome sequencing. Bacterial genomes can be sequenced in a single run with several times coverage with this technique. This technique was also used to sequence the genome of James Watson recently. The sequence of DNA encodes the necessary information for living things to survive and reproduce. Determining the sequence is therefore useful in fundamental research into why and how organisms live, as well as in applied subjects. Because of the key importance DNA has to living things, knowledge of DNA sequences is useful in practically any area of biological research. For example, in medicine it can be used to identify, diagnose, and potentially develop treatments for genetic diseases. Similarly, research into pathogens may lead to treatments for contagious diseases. Biotechnology is a burgeoning discipline, with the potential for many useful products and services. The Carlson curve is a term coined by The Economist to describe the biotechnological equivalent of Moore's law, and is named after author Rob Carlson. Carlson accurately predicted the doubling time of DNA sequencing technologies (measured by cost and performance) would be at least as fast as Moore's law. Carlson curves illustrate the rapid (in some cases hyperexponential) decreases in cost, and increases in performance, of a variety of technologies, including DNA sequencing, DNA synthesis, and a range of physical and computational tools used in protein expression and in determining protein structures.

Секвенирование Сангера

При секвенировании по методу обрыва цепи (секвенировании Сангера) удлинение инициируется в определенном месте на ДНК-шаблоне с использованием короткого олигонуклеотида – “праймера”, комплементарного шаблону в данной области. Олигонуклеотидный праймер удлиняется с помощью ДНК-полимеразы, фермента, реплицирующего ДНК. Вместе с праймером и ДНК-полимеразой добавляются четыре дезоксинуклеотидных основания (строительные блоки ДНК) и низкая концентрация нуклеотида, обрывающего цепь (чаще всего дидезоксинуклеотид). Дезоксинуклеотиды лишены OH-группы как во 2', так и в 3'-положении молекулы рибозы, поэтому после их включения в молекулу ДНК дальнейшее ее удлинение становится невозможным. В этом секвенаторе используются четыре различных сосуда, каждый из которых содержит только один из четырех дидезоксирибонуклеотидов; включение нуклеотидов, обрывающих цепь, ДНК-полимеразой в случайном положении приводит к образованию серии связанных фрагментов ДНК разной длины, заканчивающихся определенным дидезоксирибонуклеотидом. Затем фрагменты разделяют по размеру с помощью электрофореза в геле полиакриламида или, чаще, в узкой стеклянной трубке (капилляре), заполненной вязким полимером. Альтернативой маркировке праймера является маркировка терминаторов, обычно называемая “секвенированием по терминаторам с красителями”. Основное преимущество этого подхода заключается в том, что полный набор для секвенирования можно получить в одной реакции, вместо четырех, необходимых при использовании маркированного праймера. Это достигается путем маркировки каждого дидезоксинуклеотидного терминатора цепи отдельным флуоресцентным красителем, излучающим свет на разной длине волны. Этот метод проще и быстрее, чем метод с использованием красителя для праймера, но может приводить к более неравномерным пикам данных (разной высоты) из-за различий в включении объемных терминаторов цепи с красителями, зависящих от шаблона. Эта проблема была значительно уменьшена благодаря разработке новых ферментов и красителей, минимизирующих вариабельность включения. В настоящее время этот метод используется для подавляющего большинства реакций секвенирования, поскольку он проще и дешевле. Основная причина этого в том, что праймеры не требуют отдельной маркировки (что может быть значительными затратами для одноразового, специально разработанного праймера), хотя это менее актуально для часто используемых “универсальных” праймеров. Однако ситуация быстро меняется из-за растущей экономической эффективности систем второго и третьего поколений от Illumina, 454, ABI, Helicos и Dover.

In chain terminator sequencing (Sanger sequencing), extension is initiated at a specific site on the template DNA by using a short oligonucleotide 'primer' complementary to the template at that region. The oligonucleotide primer is extended using a DNA polymerase, an enzyme that replicates DNA. Included with the primer and DNA polymerase are the four deoxynucleotide bases (DNA building blocks), along with a low concentration of a chain terminating nucleotide (most commonly a di deoxynucleotide). The deoxynucleotides lack in the OH group both at the 2' and at the 3' position of the ribose molecule, therefore once they are inserted within a DNA molecule they prevent it from being further elongated. In this sequencer four different vessels are employed, each containing only of the four dideoxyribonucleotides; the incorporation of the chain terminating nucleotides by the DNA polymerase in a random position results in a series of related DNA fragments, of different sizes, that terminate with a given dideoxiribonucleotide. The fragments are then size separated by electrophoresis in a slab polyacrylamide gel, or more commonly now, in a narrow glass tube (capillary) filled with a viscous polymer. An alternative to the labelling of the primer is to label the terminators instead, commonly called 'dye terminator sequencing'. The major advantage of this approach is the complete sequencing set can be performed in a single reaction, rather than the four needed with the labeled primer approach. This is accomplished by labelling each of the dideoxynucleotide chain terminators with a separate fluorescent dye, which fluoresces at a different wavelength. This method is easier and quicker than the dye primer approach, but may produce more uneven data peaks (different heights), due to a template dependent difference in the incorporation of the large dye chain terminators. This problem has been significantly reduced with the introduction of new enzymes and dyes that minimize incorporation variability. This method is now used for the vast majority of sequencing reactions as it is both simpler and cheaper. The major reason for this is that the primers do not have to be separately labelled (which can be a significant expense for a single use custom primer), although this is less of a concern with frequently used 'universal' primers. This is changing rapidly due to the increasing cost effectiveness of second and third generation systems from Illumina, 454, ABI, Helicos, and Dover.

Пиросеквенсирование

Метод пиросеквенирования основан на обнаружении высвобождения пирофосфата при инкорпорации нуклеотидов. Перед проведением пиросеквенирования нить ДНК, подлежащая секвенированию, должна быть амплифицирована с помощью ПЦР. Затем определяется порядок добавления нуклеотидов в секвенатор (например, G A T C). При добавлении конкретного нуклеотида, если ДНК-полимераза включает его в растущую цепь, высвобождается пирофосфат, который преобразуется в АТФ с помощью АТФ-сульфурилазы. АТФ обеспечивает окисление люциферазы посредством люциферазы; эта реакция генерирует световой сигнал, регистрируемый в виде пика пирограммы. Таким образом, инкорпорация нуклеотида коррелирует с сигналом. Интенсивность светового сигнала пропорциональна количеству инкорпорированных нуклеотидов во время синтеза нити ДНК (например, два инкорпорированных нуклеотида соответствуют двум пикам пирограммы). Если добавленные нуклеотиды не включаются в молекулу ДНК, сигнал не регистрируется; фермент апираза удаляет любые неинкорпорированные нуклеотиды, оставшиеся в реакционной смеси. Этот метод не требует использования флуоресцентно меченных нуклеотидов или гелевого электрофореза. Пиросеквенирование, разработанное Полом Найреном и Мостафой Ронаги, было коммерциализировано компаниями Biotage (для секвенирования с низкой пропускной способностью) и 454 Life Sciences (для секвенирования с высокой пропускной способностью). Последняя платформа секвенирует примерно 100 мегабаз [в настоящее время до 400 мегабаз] за семь часов работы на одном приборе. В методе на основе массива (коммерциализированном 454 Life Sciences) одноцепочечная ДНК отжигается на бусинах и амплифицируется с помощью EmPCR. Эти бусины, связанные с ДНК, затем помещаются в лунки на оптоволоконном чипе вместе с ферментами, которые производят свет в присутствии АТФ. При промывании свободных нуклеотидов по чипу генерируется свет, поскольку АТФ образуется при присоединении нуклеотидов к их комплементарным основаниям. Добавление одного (или нескольких) нуклеотидов приводит к реакции, генерирующей световой сигнал, который регистрируется ПЗС-камерой прибора. Интенсивность сигнала пропорциональна количеству нуклеотидов, например, гомополимерных участков, включенных в единичный поток нуклеотидов.

The pyrosequencing method is based on the detection of the pyrophosphate release on nucleotide incorporation. Before performing pyrosequencing, the DNA strand to sequence has to be amplified by PCR. Then the order in which the nucleotides have to be added in the sequencer is chosen (i. e. G A T C). When a specific nucleotide is added, if the DNA polymerase incorporates it in the growing chain, the pyrophosphate is released and converted into ATP by ATP sulfurylase. ATP powers the oxidation of luciferase through the luciferase; this reaction generates a light signal recorded as a pyrogram peak. In this way, the nucleotide incorporation is correlated to a signal. The light signal is proportional to the amount of nucleotides incorporated during the synthesis of the DNA strand (i. e. two nucleotides incorporated correspond to two pyrogram peaks). When the added nucleotides aren't incorporated in the DNA molecule, no signal is recorded; the enzyme apyrase removes any unincorporated nucleotide remaining in the reaction. This method requires neither fluorescently labelled nucleotides nor gel electrophoresis. Pyrosequencing, which was developed by Pål Nyrén and Mostafa Ronaghi DNA, has been commercialized by Biotage (for low throughput sequencing) and 454 Life Sciences (for high throughput sequencing). The latter platform sequences roughly 100 megabases [now up to 400 megabases] in a seven hour run with a single machine. In the array based method (commercialized by 454 Life Sciences), single stranded DNA is annealed to beads and amplified via EmPCR. These DNA bound beads are then placed into wells on a fiber optic chip along with enzymes which produce light in the presence of ATP. When free nucleotides are washed over this chip, light is produced as ATP is generated when nucleotides join with their complementary base pairs. Addition of one (or more) nucleotide(s) results in a reaction that generates a light signal that is recorded by the CCD camera in the instrument. The signal strength is proportional to the number of nucleotides, for example, homopolymer stretches, incorporated in a single nucleotide flow.

Крупномасштабное секвенирование

В то время как описанные выше методы описывают различные способы секвенирования, для обозначения секвенирования значительной части генома используются отдельные, связанные термины. Были разработаны различные платформы для проведения секвенирования экзома (подмножества всей ДНК во всех хромосомах, кодирующей гены) или секвенирования всего генома (секвенирования всей ядерной ДНК человека).

РНК-секвенцирование

РНК менее стабильна в клетке и также более подвержена атаке нуклеаз в экспериментальных условиях. Поскольку РНК образуется в результате транскрипции из ДНК, информация уже присутствует в ДНК клетки. Однако иногда желательно секвенировать молекулы РНК. В то время как секвенирование ДНК дает генетический профиль организма, секвенирование РНК отражает только те последовательности, которые активно экспрессируются в клетках. Для секвенирования РНК обычно сначала проводят обратную транскрипцию РНК, выделенной из образца, для получения фрагментов кДНК. Затем эти фрагменты можно секвенировать, как описано выше. Большая часть РНК, экспрессируемая в клетках, представлена рибосомной РНК или малыми РНК, которые не способствуют клеточному трансляционному процессу, но часто не являются предметом исследования. Однако эту фракцию можно удалить in vitro для обогащения мессенджерной РНК, которая также присутствует и обычно представляет интерес. Эти мРНК, происходящие из экзонов, впоследствии будут транслироваться в белки, поддерживающие определенные клеточные функции. Таким образом, профиль экспрессии указывает на клеточную активность, что особенно важно при изучении заболеваний, клеточного поведения и реакций на реагенты или стимулы. Молекулы эукариотической РНК не обязательно коллинейны со своим ДНК-матрицей, поскольку интроны вырезаются. Это создает определенную сложность при сопоставлении полученных последовательностей с геномом для определения их происхождения. Более подробную информацию о возможностях секвенирования нового поколения, применяемого к полным транскриптомам, можно найти в разделах: RNA-Seq и секвенирование микроРНК.

Полисахаридная секвенирование

Хотя полисахариды также являются биополимерами, говорить о "секвенировании" полисахарида не так распространено по нескольким причинам. Хотя многие полисахариды линейны, многие имеют разветвления. Может использоваться множество различных звеньев (отдельных моносахаридов), соединенных различными способами. Однако основная теоретическая причина заключается в том, что, в то время как другие полимеры, перечисленные здесь, в основном синтезируются "шаблон-зависимым" образом одним процессивным ферментом, каждое отдельное соединение в полисахариде может быть образовано другим ферментом. Во многих случаях сборка не является однозначно определенной; в зависимости от действующего фермента, может быть включено одно из нескольких различных звеньев. Это может привести к образованию семейства схожих молекул. Это особенно характерно для растительных полисахаридов. Методы определения структуры олигосахаридов и полисахаридов включают спектроскопию ЯМР и анализ метилирования.

Ссылки

Секвенирование (полное описание)