Круговой дихроизм: дифференциальное поглощение циркулярно поляризованного света.

Введение

Дихроизм с использованием циркулярно поляризованного света. Круговой дихроизм (CD) – это дихроизм, связанный с циркулярно поляризованным светом, то есть дифференциальное поглощение лево- и правовращающегося света. Левовращающий (LHC) и правовращающий (RHC) циркулярно поляризованный свет представляют собой два возможных состояния спинового углового момента фотона, поэтому круговой дихроизм также называют дихроизмом по спиновому угловому моменту. Это явление было открыто Жаном Батистом Био, Августеном Френелем и Айме Коттоном в первой половине XIX века. Круговой дихроизм и круговой двулучепреломление являются проявлениями оптической активности. Он наблюдается в полосах поглощения оптически активных хиральных молекул. Спектроскопия CD имеет широкий спектр применения в различных областях. В частности, УФ-КД используется для исследования вторичной структуры белков. УФ/Vis-КД используется для исследования переходов переноса заряда. Круговой дихроизм в ближней инфракрасной области используется для исследования геометрической и электронной структуры путем зондирования d→d переходов металлов. Это поперечная волна. В то время как линейно поляризованный свет возникает, когда вектор электрического поля колеблется только в одной плоскости, циркулярно поляризованный свет возникает, когда направление вектора электрического поля вращается вокруг направления распространения, при этом вектор сохраняет постоянную величину. В одной точке пространства вектор циркулярной поляризации описывает окружность за один период частоты волны, отсюда и название. На двух диаграммах ниже показаны векторы электрического поля линейно и циркулярно поляризованного света в один момент времени для ряда положений; график циркулярно поляризованного электрического вектора образует спираль вдоль направления распространения. Для левовращающегося циркулярно поляризованного света (LCP), распространяющегося к наблюдателю, электрический вектор вращается против часовой стрелки. Дифференциальное пропускание (и отражение) циркулярно поляризованных волн также зависит от направления распространения света через вещество. В этом случае так называемая внешняя 3D-хиральность связана с взаимной ориентацией светового пучка и структуры.

Dichroism with circularly polarized light
Circular dichroism (CD) is dichroism involving circularly polarized light, i. e., the differential absorption of left and right handed light. Left hand circular (LHC) and right hand circular (RHC) polarized light represent two possible spin angular momentum states for a photon, and so circular dichroism is also referred to as dichroism for spin angular momentum. This phenomenon was discovered by Jean Baptiste Biot, Augustin Fresnel, and Aimé Cotton in the first half of the 19th century. Circular dichroism and circular birefringence are manifestations of optical activity. It is exhibited in the absorption bands of optically active chiral molecules. CD spectroscopy has a wide range of applications in many different fields. Most notably, UV CD is used to investigate the secondary structure of proteins. UV/Vis CD is used to investigate charge transfer transitions. Near infrared CD is used to investigate geometric and electronic structure by probing metal d→d transitions. a transverse wave. While linearly polarized light occurs when the electric field vector oscillates only in one plane, circularly polarized light occurs when the direction of the electric field vector rotates about its propagation direction while the vector retains constant magnitude. At a single point in space, the circularly polarized vector will trace out a circle over one period of the wave frequency, hence the name. The two diagrams below show the electric field vectors of linearly and circularly polarized light, at one moment of time, for a range of positions; the plot of the circularly polarized electric vector forms a helix along the direction of propagation For left circularly polarized light (LCP) with propagation towards the observer, the electric vector rotates counterclockwise. including differential transmission (and reflection) of circularly polarized waves also depends on the propagation direction through the material. In this case, so called extrinsic 3d chirality is associated with the mutual orientation of light beam and structure.

Средняя эллиптичность остатков

Методы оценки вторичной структуры в полимерах, белках и полипептидах, в частности, часто требуют приведения измеренного спектра молярной эллиптичности к нормализованному значению, а именно – к значению, не зависящему от длины полимера. Для этого используется эллиптичность, приходящаяся на один остаток; она определяется как измеренная молярная эллиптичность молекулы, деленная на число мономерных звеньев (остатков) в этой молекуле.

Применение к биологическим молекулам

В целом, это явление будет проявляться в полосах поглощения любой оптически активной молекулы. Как следствие, циркулярный дихроизм наблюдается в биологических молекулах из-за их декстро- и левовращающих компонентов. Еще более важно, что вторичная структура также придает своим соответствующим молекулам характерный CD-спектр. Поэтому альфа-спираль белков и двойная спираль нуклеиновых кислот имеют CD-спектральные сигнатуры, отражающие их структуру. Способность CD давать репрезентативную структурную подпись делает его мощным инструментом в современной биохимии с областями применения, охватывающими практически все направления исследований. CD тесно связано с методом оптической вращательной дисперсии (ORD) и обычно считается более совершенным. CD измеряется в или вблизи полос поглощения интересующей молекулы, в то время как ORD может измеряться вдали от этих полос. Преимущество CD очевидно при анализе данных. Структурные элементы различаются более четко, поскольку их зарегистрированные полосы не перекрываются в значительной степени на определенных длинах волн, как это происходит в ORD. В принципе, эти два спектральных измерения могут быть преобразованы друг в друга с помощью интегрального преобразования (соотношение Крамерса — Кронига), если все поглощения учтены в измерениях. Дальний УФ-спектр белков может выявить важные характеристики их вторичной структуры. CD-спектры можно легко использовать для оценки доли молекулы, находящейся в альфа-спиральной, бета-листовой, бета-поворотной или другой (например, случайной) конформации. Эти фракционные определения накладывают важные ограничения на возможные вторичные конформации белка. Как правило, CD не позволяет определить местоположение обнаруженных альфа-спиралей внутри молекулы или даже точно предсказать их количество. Тем не менее, CD является ценным инструментом, особенно для выявления изменений конформации. Например, его можно использовать для изучения того, как вторичная структура молекулы изменяется в зависимости от температуры или концентрации денатурирующих агентов, таких как хлорид гуанидина или мочевина. Таким образом, он может выявить важную термодинамическую информацию о молекуле (например, энтальпию и свободную энергию Гиббса денатурации), которую в противном случае трудно получить. Любой, кто занимается изучением белка, сочтет CD ценным инструментом для подтверждения того, что белок находится в своей нативной конформации, прежде чем приступать к обширным и/или дорогостоящим экспериментам с ним. Кроме того, существует ряд других применений CD-спектроскопии в химии белков, не связанных с оценкой доли альфа-спирали. Более того, CD-спектроскопия использовалась в исследованиях бионеорганических интерфейсов. В частности, она использовалась для анализа различий во вторичной структуре сконструированного белка до и после титрования реагентом. Ближний УФ-спектр белков (>250 нм) предоставляет информацию о третичной структуре. Сигналы, полученные в области 250–300 нм, обусловлены поглощением, ориентацией диполей и природой окружения аминокислот фенилаланина, тирозина, цистеина (или S–S дисульфидных мостиков) и триптофана. В отличие от дальнего УФ-CD, ближний УФ-спектр нельзя отнести к какой-либо конкретной трехмерной структуре. Скорее, ближние УФ-спектры CD предоставляют структурную информацию о природе протезных групп в белках, например, гемовых групп в гемоглобине и цитохроме c.

In general, this phenomenon will be exhibited in absorption bands of any optically active molecule. As a consequence, circular dichroism is exhibited by biological molecules, because of their dextrorotary and levorotary components. Even more important is that a secondary structure will also impart a distinct CD to its respective molecules. Therefore, the alpha helix of proteins and the double helix of nucleic acids have CD spectral signatures representative of their structures. The capacity of CD to give a representative structural signature makes it a powerful tool in modern biochemistry with applications that can be found in virtually every field of study. CD is closely related to the optical rotatory dispersion (ORD) technique, and is generally considered to be more advanced. CD is measured in or near the absorption bands of the molecule of interest, while ORD can be measured far from these bands. CD's advantage is apparent in the data analysis. Structural elements are more clearly distinguished since their recorded bands do not overlap extensively at particular wavelengths as they do in ORD. In principle, these two spectral measurements can be interconverted through an integral transform (Kramers–Kronig relation), if all the absorptions are included in the measurements. The far UV (ultraviolet) CD spectrum of proteins can reveal important characteristics of their secondary structure. CD spectra can be readily used to estimate the fraction of a molecule that is in the alpha helix conformation, the beta sheet conformation, the beta turn conformation, or some other (e. g. random coil) conformation. These fractional assignments place important constraints on the possible secondary conformations that the protein can be in. CD cannot, in general, say where the alpha helices that are detected are located within the molecule or even completely predict how many there are. Despite this, CD is a valuable tool, especially for showing changes in conformation. It can, for instance, be used to study how the secondary structure of a molecule changes as a function of temperature or of the concentration of denaturing agents, e. g. Guanidinium chloride or urea. In this way it can reveal important thermodynamic information about the molecule (such as the enthalpy and Gibbs free energy of denaturation) that cannot otherwise be easily obtained. Anyone attempting to study a protein will find CD a valuable tool for verifying that the protein is in its native conformation before undertaking extensive and/or expensive experiments with it. Also, there are a number of other uses for CD spectroscopy in protein chemistry not related to alpha helix fraction estimation. Moreover, CD spectroscopy has been used in bioinorganic interface studies. Specifically it has been used to analyze the differences in secondary structure of an engineered protein before and after titration with a reagent. The near UV CD spectrum (>250 nm) of proteins provides information on the tertiary structure. The signals obtained in the 250–300 nm region are due to the absorption, dipole orientation and the nature of the surrounding environment of the phenylalanine, tyrosine, cysteine (or S S disulfide bridges) and tryptophan amino acids. Unlike in far UV CD, the near UV CD spectrum cannot be assigned to any particular 3D structure. Rather, near UV CD spectra provide structural information on the nature of the prosthetic groups in proteins, e. g., the heme groups in hemoglobin and cytochrome c.

Видимая CD-спектроскопия — очень мощный метод изучения взаимодействий металл-белок и позволяет разделять отдельные электронные переходы d–d в виде отдельных полос. CD-спектры в области видимого света образуются только тогда, когда ион металла находится в хиральной среде, поэтому свободные ионы металла в растворе не обнаруживаются. Это дает преимущество в виде наблюдения только металла, связанного с белком, что позволяет легко определить зависимость от pH и стехиометрию. Оптическая активность в комплексах переходных металлов объясняется конфигурационными, конформационными и вицинальными эффектами. Клевпатинонд и Вилес (2007) разработали набор эмпирических правил для прогнозирования появления видимых CD-спектров для Cu2+ и Ni2+ квадратных плоских комплексов, содержащих гистидин и координацию основной цепи. CD дает менее специфическую структурную информацию, чем, например, рентгеновская кристаллография и спектроскопия ЯМР белков, которые предоставляют данные с атомным разрешением. Однако CD-спектроскопия является быстрым методом, не требующим больших количеств белков или сложной обработки данных. Таким образом, CD можно использовать для изучения большого количества условий растворителя, изменяя температуру, pH, соленость и присутствие различных кофакторов. CD-спектроскопия обычно используется для изучения белков в растворе и, таким образом, дополняет методы, изучающие твердое тело. Это также является ограничением, поскольку многие белки в своем нативном состоянии встроены в мембраны, а растворы, содержащие мембранные структуры, часто сильно рассеивают свет. CD иногда измеряется в тонких пленках. CD-спектроскопия также проводилась с использованием полупроводниковых материалов, таких как TiO2, для получения сильных сигналов в УФ-диапазоне длин волн, где часто происходят электронные переходы биомолекул.

Ограничения эксперимента

CD также изучался в контексте углеводов, но с ограниченным успехом из-за экспериментальных трудностей, связанных с измерением спектров CD в вакуумной ультрафиолетовой (VUV) области спектра (100–200 нм), где расположены соответствующие CD-полосы незамещенных углеводов. Замещенные углеводы с полосами выше VUV-области были успешно измерены. Измерение CD также осложняется тем, что типичные водные буферные системы часто поглощают в диапазоне, где структурные особенности проявляют дифференциальное поглощение циркулярно поляризованного света. Буферы фосфата, сульфата, карбоната и ацетата, как правило, несовместимы с CD, если только они не сделаны чрезвычайно разбавленными, например, в диапазоне 10–50 мМ. Буферную систему TRIS следует полностью избегать при проведении измерений CD в дальней ультрафиолетовой области. Бораты и соединения ония часто используются для установления подходящего диапазона pH для экспериментов с CD. Некоторые исследователи заменили ион хлорида фторидом, поскольку фторид меньше поглощает в дальней ультрафиолетовой области, а другие работали в чистой воде. Другая, почти универсальная, техника – минимизировать поглощение растворителя, используя кюветы с меньшей длиной оптического пути при работе в дальней УФ, длины пути 0,1 мм не являются редкостью в данной области. Помимо измерений в водных системах, CD, особенно в дальней ультрафиолетовой области, может быть измерен в органических растворителях, например, этаноле, метаноле, трифторэтаноле (TFE). Последний имеет преимущество, заключающееся в индуцировании формирования структуры белков, вызывая образование бета-листов в одних и альфа-спиралей в других, что они не проявляли бы в обычных водных условиях. Однако большинство распространенных органических растворителей, таких как ацетонитрил, ТГФ, хлороформ, дихлорметан, несовместимы с измерениями CD в дальней ультрафиолетовой области. Стоит отметить, что спектры CD белков, используемые для оценки вторичной структуры, связаны с π–π* поглощениями амидных связей, соединяющих аминокислоты. Эти полосы поглощения частично лежат в так называемой вакуумной ультрафиолетовой области (длина волны менее примерно 200 нм). Данный диапазон длин волн фактически недоступен в воздухе из-за сильного поглощения света кислородом на этих длинах волн. На практике эти спектры измеряются не в вакууме, а в приборе, свободном от кислорода (заполненном чистым газом азота). После удаления кислорода, возможно, второй по важности технический фактор при работе ниже 200 нм – это проектирование остальной части оптической системы с минимальными потерями в этом диапазоне. В этой связи критически важно использование алюминированных зеркал, покрытия которых оптимизированы для минимизации потерь в данной области спектра. Обычно источником света в этих приборах является высоковольтная ксеноновая лампа с короткой дугой. Обычные ксеноновые дуговые лампы не подходят для использования в дальней ультрафиолетовой области. Вместо этого необходимо использовать специально изготовленные лампы с колбами из синтетического кварца высокой чистоты. Свет от синхротронных источников имеет гораздо более высокий поток на коротких длинах волн и использовался для регистрации CD до 160 нм. В 2010 году CD-спектрофотометр на кольцевом накопителе электронов ISA в университете Орхуса в Дании был использован для регистрации спектров CD твердого тела до 120 нм. На квантово-механическом уровне плотность характеристик кругового дихроизма и оптического вращения идентичны. Оптическая вращающаяся дисперсия и круговой дихроизм содержат одинаковый объем квантовой информации.

CD has also been studied in carbohydrates, but with limited success due to the experimental difficulties associated with measurement of CD spectra in the vacuum ultraviolet (VUV) region of the spectrum (100–200 nm), where the corresponding CD bands of unsubstituted carbohydrates lie. Substituted carbohydrates with bands above the VUV region have been successfully measured. Measurement of CD is also complicated by the fact that typical aqueous buffer systems often absorb in the range where structural features exhibit differential absorption of circularly polarized light. Phosphate, sulfate, carbonate, and acetate buffers are generally incompatible with CD unless made extremely dilute e. g. in the 10–50 mM range. The TRIS buffer system should be completely avoided when performing far UV CD. Borate and Onium compounds are often used to establish the appropriate pH range for CD experiments. Some experimenters have substituted fluoride for chloride ion because fluoride absorbs less in the far UV, and some have worked in pure water. Another, almost universal, technique is to minimize solvent absorption by using shorter path length cells when working in the far UV, 0.1 mm path lengths are not uncommon in this work. In addition to measuring in aqueous systems, CD, particularly far UV CD, can be measured in organic solvents e. g. ethanol, methanol, trifluoroethanol (TFE). The latter has the advantage to induce structure formation of proteins, inducing beta sheets in some and alpha helices in others, which they would not show under normal aqueous conditions. Most common organic solvents such as acetonitrile, THF, chloroform, dichloromethane are however, incompatible with far UV CD. It may be of interest to note that the protein CD spectra used in secondary structure estimation are related to the π to π* orbital absorptions of the amide bonds linking the amino acids. These absorption bands lie partly in the so called vacuum ultraviolet (wavelengths less than about 200 nm). The wavelength region of interest is actually inaccessible in air because of the strong absorption of light by oxygen at these wavelengths. In practice these spectra are measured not in vacuum but in an oxygen free instrument (filled with pure nitrogen gas). Once oxygen has been eliminated, perhaps the second most important technical factor in working below 200 nm is to design the rest of the optical system to have low losses in this region. Critical in this regard is the use of aluminized mirrors whose coatings have been optimized for low loss in this region of the spectrum. The usual light source in these instruments is a high pressure, short arc xenon lamp. Ordinary xenon arc lamps are unsuitable for use in the low UV. Instead, specially constructed lamps with envelopes made from high purity synthetic fused silica must be used. Light from synchrotron sources has a much higher flux at short wavelengths, and has been used to record CD down to 160 nm. In 2010 the CD spectrophotometer at the electron storage ring facility ISA at the University of Aarhus in Denmark was used to record solid state CD spectra down to 120 nm. At the quantum mechanical level, the feature density of circular dichroism and optical rotation are identical. Optical rotary dispersion and circular dichroism share the same quantum information content.