Сравнивайте с английским: нажмите на абзац — оригинал откроется в окне. Кнопка EN под абзацем показывает его прямо в тексте.
Содержание
Введение
Флуоресцентный краситель DAPI (произносится как "DAPPY", /ˈdæpiː/), или 4′,6-диамидино-2-фенилиндол, — это флуоресцентный краситель, который прочно связывается с участками ДНК, богатыми аденом и тимином. Он широко используется во флуоресцентной микроскопии. Поскольку DAPI способен проникать через неповрежденную клеточную мембрану, его можно использовать для окрашивания как живых, так и фиксированных клеток, хотя проникновение в живые клетки происходит менее эффективно, что позволяет использовать его в качестве маркера жизнеспособности мембраны.
Fluorescent stain
DAPI (pronounced 'DAPPY', /ˈdæpiː/), or 4′,6 diamidino 2 phenylindole, is a fluorescent stain that binds strongly to adenine–thymine rich regions in DNA. It is used extensively in fluorescence microscopy. As DAPI can pass through an intact cell membrane, it can be used to stain both live and fixed cells, though it passes through the membrane less efficiently in live cells and therefore provides a marker for membrane viability.
История
DAPI был впервые синтезирован в 1971 году в лаборатории Отто Данна в ходе поиска лекарств для лечения трипаносомоза. Хотя он не показал эффективности в качестве лекарственного средства, дальнейшие исследования выявили его сильное связывание с ДНК и увеличение флуоресценции при связывании. Это привело к его применению в идентификации митохондриальной ДНК при ультрацентрифугировании в 1975 году – это было первое задокументированное использование DAPI в качестве флуоресцентного красителя ДНК. Высокая флуоресценция при связывании с ДНК способствовала быстрому внедрению DAPI для флуоресцентного окрашивания ДНК в флуоресцентной микроскопии. Его применение для обнаружения ДНК в клетках растений, метазоа и бактерий, а также вирусных частиц, было продемонстрировано в конце 1970-х годов, а количественное окрашивание ДНК внутри клеток – в 1977 году. Примерно в это же время было показано использование DAPI в качестве красителя ДНК для проточной цитометрии. DAPI также связывается с РНК, хотя и не так сильно флуоресцирует. При связывании с РНК его эмиссия сдвигается до примерно 500 нм. Синяя эмиссия DAPI удобна для микроскопистов, желающих использовать несколько флуоресцентных красителей в одном образце. Существует некоторое перекрытие флуоресценции между DAPI и зелеными флуоресцентными молекулами, такими как флуоресцеин и зеленый флуоресцентный белок (GFP), однако этот эффект незначителен. При необходимости высокоточного анализа изображений можно использовать спектральное разделение для учета этого эффекта. Помимо аналитической флуоресцентной световой микроскопии, DAPI также популярен для мечения клеточных культур с целью обнаружения ДНК контаминирующих микоплазм или вирусов. Окрашенные DAPI частицы микоплазмы или вируса в питательной среде флуоресцируют, что облегчает их обнаружение.
DAPI was first synthesised in 1971 in the laboratory of Otto Dann as part of a search for drugs to treat trypanosomiasis. Although it was unsuccessful as a drug, further investigation indicated it bound strongly to DNA and became more fluorescent when bound. This led to its use in identifying mitochondrial DNA in ultracentrifugation in 1975, the first recorded use of DAPI as a fluorescent DNA stain. Strong fluorescence when bound to DNA led to the rapid adoption of DAPI for fluorescent staining of DNA for fluorescence microscopy. Its use for detecting DNA in plant, metazoa and bacteria cells and virus particles was demonstrated in the late 1970s, and quantitative staining of DNA inside cells was demonstrated in 1977. Use of DAPI as a DNA stain for flow cytometry was also demonstrated around this time. DAPI will also bind to RNA, though it is not as strongly fluorescent. Its emission shifts to around 500 nm when bound to RNA. DAPI's blue emission is convenient for microscopists who wish to use multiple fluorescent stains in a single sample. There is some fluorescence overlap between DAPI and green fluorescent molecules like fluorescein and green fluorescent protein (GFP) but the effect of this is small. Use of spectral unmixing can account for this effect if extremely precise image analysis is required. Outside of analytical fluorescence light microscopy DAPI is also popular for labeling of cell cultures to detect the DNA of contaminating Mycoplasma or virus. The labelled Mycoplasma or virus particles in the growth medium fluoresce once stained by DAPI making them easy to detect.
Моделирование свойств поглощения и флуоресценции
Этот ДНК-флуоресцентный зонд был успешно смоделирован с использованием теории функционала плотности во временной зависимости, в сочетании с версией IEF поляризуемой континуальной модели. Это квантово-механическое моделирование объясняет наблюдаемые спектры поглощения и флуоресценции, связанные с взаимодействием зонда с малым желобком ДНК и интеркаляцией в ДНК-карман, за счет снижения структурной гибкости и поляризуемости.
This DNA fluorescent probe has been effectively modeled using the time dependent density functional theory, coupled with the IEF version of the polarizable continuum model. This quantum mechanical modeling has rationalized the absorption and fluorescence behavior given by minor groove binding and intercalation in the DNA pocket, in term of a reduced structural flexibility and polarization.
Живые клетки и токсичность
DAPI может использоваться для окрашивания фиксированных клеток. Концентрация DAPI, необходимая для окрашивания живых клеток, обычно очень высока, поэтому его редко применяют для живых клеток. Согласно паспорту безопасности (MSDS), вещество считается нетоксичным, и хотя мутагенности по отношению к E. coli выявлено не было, в информации от производителя DAPI указан как известный мутаген. Учитывая, что это небольшое соединение, связывающееся с ДНК, вероятно наличие определенных канцерогенных свойств, поэтому необходимо соблюдать осторожность при работе с ним и утилизации.
DAPI can be used for fixed cell staining. The concentration of DAPI needed for live cell staining is generally very high; it is rarely used for live cells. It is labeled non toxic in its MSDS and though it was not shown to have mutagenicity to E. coli, it is labelled as a known mutagen in manufacturer information. As it is a small DNA binding compound, it is likely to have some carcinogenic effects and care should be taken in its handling and disposal.
Альтернативы
Красители Hoechst аналогичны DAPI тем, что также представляют собой синие флуоресцентные красители ДНК, совместимые как с живыми, так и с фиксированными клетками, и могут быть визуализированы с использованием тех же настроек фильтров оборудования, что и для DAPI.
The Hoechst stains are similar to DAPI in that they are also blue fluorescent DNA stains which are compatible with both live and fixed cell applications, as well as visible using the same equipment filter settings as for DAPI.