Введение
Триарилметановый краситель, используемый в качестве гистологического красителя и в методе Грама для классификации бактерий.
Кристаллический фиолетовый, или генциан-фиолетовый, также известный как метилфиолетовый 10B или гексаметилпарарозанилиновый хлорид, является триарилметановым красителем, используемым в качестве гистологического красителя и в методе Грама для классификации бактерий. Кристаллический фиолетовый обладает антибактериальными, противогрибковыми и противогельминтными (вермицидными) свойствами и ранее широко использовался в качестве местного антисептика. Медицинское применение красителя в значительной степени вытеснено более современными препаратами, хотя он по-прежнему входит в список Всемирной организации здравоохранения. Название "генциан-фиолетовый" первоначально использовалось для смеси метилпарарозанилиновых красителей (метилфиолетовый), но теперь часто рассматривается как синоним кристаллического фиолетового. Название связано с его цветом, напоминающим цвет лепестков некоторых видов генциан; он не производится из генциан или фиалок.
Цвет красителя
При растворении в воде краситель имеет сине-фиолетовый цвет с максимальным поглощением при 590 нм и молярным коэффициентом поглощения 87 000 М⁻¹ см⁻¹. Цвет красителя зависит от кислотности раствора. При pH +1,0 краситель зелёный с максимумами поглощения при 420 нм и 620 нм, а в сильно кислом растворе (pH -1,0) – жёлтый с максимальным поглощением при 420 нм. Различные цвета обусловлены различными заряженными состояниями молекулы красителя. В жёлтой форме все три атома азота несут положительный заряд, два из которых протонированы, в то время как зелёный цвет соответствует форме красителя с двумя положительно заряженными атомами азота. При нейтральном pH оба дополнительных протона уходят в раствор, оставляя только один атом азота положительно заряженным. Значения pKa для потери двух протонов составляют приблизительно 1,15 и 1,8. Его иногда используют для окрашивания различных продуктов, таких как удобрения, антифриз, моющие средства и кожа. Синяя маркировочная жидкость, используемая для разметки деталей при металлообработке, состоит из денатурированного спирта, шеллака и генцианвиолета.
Наука
При проведении гелевого электрофореза ДНК кристаллическая фиолетка может использоваться как нетоксичный краситель ДНК в качестве альтернативы флуоресцентным интеркалирующим красителям, таким как бромид этидия. При таком использовании ее можно либо добавлять в гель агарозы, либо наносить после завершения электрофореза. При концентрации 0,001% и выдержке 30 минут после электрофореза, она способна обнаруживать до 16 нг ДНК. Использование метилоранжевого контрастного красителя и более сложной методики окрашивания позволяет повысить чувствительность до 8 нг ДНК. При использовании кристаллической фиолетки вместо флуоресцентных красителей, ультрафиолетовое облучение не требуется, что сделало ее популярной для предотвращения УФ-индуцированного повреждения ДНК при клонировании ДНК in vitro. В биомедицинских исследованиях кристаллическая фиолетка может использоваться для окрашивания ядер прикрепленных клеток. В этом случае кристаллическая фиолетка действует как интеркалирующий краситель и позволяет количественно определять ДНК, что пропорционально количеству клеток. Краситель применяется как гистологический краситель, в частности, для окраски по Граму при классификации бактерий. В криминалистике кристаллическая фиолетка использовалась для выявления отпечатков пальцев. Она также применяется как краситель тканей при подготовке микропрепаратов для световой микроскопии. В лаборатории растворы, содержащие кристаллическую фиолетку и формалин, часто используются для одновременной фиксации и окрашивания клеток, выращенных в культуре тканей, для их сохранения и облегчения визуализации, поскольку большинство клеток бесцветны. Иногда ее также используют как недорогой способ нанесения идентификационных отметок на лабораторных мышей, поскольку у многих линий лабораторных мышей альбинизм, и фиолетовый цвет сохраняется на шерсти в течение нескольких недель. Кристаллическую фиолетку можно использовать как альтернативу Cоомассие brilliant blue (CBB) при окрашивании белков, разделенных с помощью SDS-PAGE, демонстрируя, по сообщениям, пятикратное увеличение чувствительности по сравнению с CBB.
Ветеринарная
Из-за своей антимикробной активности он используется для лечения ихтиофтириоза у рыб. Однако, как правило, его использование запрещено в рыбе, предназначенной в пищу людям.
Синтез
Кристаллический фиолетовый является одним из компонентов метилфиолетового красителя, впервые синтезированного Чарльзом Лаутом в 1861 году. Начиная с 1866 года, метилфиолетовый производился фирмой Poirrier et Chappat, базирующейся в Сен-Дени, и продавался под названием "Violet de Paris". Он представлял собой смесь тетра-, пента- и гексаметилированных парарозанилинов. Сам кристаллический фиолетовый был впервые синтезирован в 1883 году Альфредом Керном (1850–1893), работавшим в Базеле на фирме Bindschedler and Busch. Для оптимизации сложного синтеза, в котором использовался высокотоксичный фосген, Керн начал сотрудничество с немецким химиком Генрихом Каро из BASF. Керн также обнаружил, что, используя диэтиланилин вместо диметиланилина в качестве исходного вещества, он может синтезировать близкий по структуре фиолетовый краситель, известный сегодня как C. I. 42600 или C. I. Основной фиолетовый 4.
Виолетовый джентиан
Название "генцианская фиолетовая" (или Gentianaviolett по-немецки) предположительно было введено немецким фармацевтом Георгом Грюблером, который в 1880 году основал в Лейпциге компанию, специализирующуюся на продаже окрашивающих реагентов для гистологии. Генцианская фиолетовая краска, продаваемая Грюблером, вероятно, содержала смесь метилированных парарозанилиновых красителей. Краска оказалась популярной, и в 1884 году Ханс Кристиан Грам использовал её для окрашивания бактерий. Он отдал должное Полу Эрлиху за смесь анилина и генцианской фиолетовой. Генцианская фиолетовая Грюблера, вероятно, была очень похожа, если не идентична, метилфиолетовой Лаута, которая использовалась в качестве красителя Виктором Андре Корнилем в 1875 году. Хотя название "генцианская фиолетовая" продолжало использоваться для гистологического окрашивания, в промышленности красителей и текстиля оно не применялось. Состав краски не был чётко определён, и разные поставщики использовали различные смеси. В 1922 году Комиссия по биологическим краскам назначила комитет под председательством Гарольда Конна для оценки пригодности различных коммерческих продуктов. В 1890 году он опубликовал монографию о бактерицидном эффекте раствора, который он назвал "пиоктанином", который, вероятно, представлял собой смесь анилиновых красителей, сходных с генцианской фиолетовой. Он организовал сотрудничество с E. Merck & Co. для продвижения "Pyoktanin caeruleum" в качестве антисептика. В 1902 году Дригальски и Конради обнаружили, что, хотя кристаллическая фиолетовая подавляет рост многих бактерий, она оказывает незначительное влияние на Bacillus coli (Escherichia coli) и Bacillus typhi (Salmonella typhi), которые являются грамотрицательными бактериями. Гораздо более подробное исследование влияния генцианской фиолетовой Грюблера на различные штаммы бактерий было опубликовано Джоном Черчманом в 1912 году. Он обнаружил, что большинство грамположительных бактерий (окрашивающихся) были чувствительны к красителю, в то время как большинство грамотрицательных бактерий (не окрашивающихся) – нет, и отметил, что краситель, скорее, действует как бактериостатический агент, чем бактерицид.
Меры предосторожности
Одно исследование на мышах продемонстрировало наличие канцерогенного потенциала, зависящего от дозы, в нескольких различных органах. Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (FDA) установило, что достаточными научными данными не было доказано, что генциан виолетовый безопасен для использования в кормах для животных. Использование генциан виолетового в кормах для животных приводит к фальсификации кормов и является нарушением Федерального закона о пищевых продуктах, лекарствах и косметике в США. 28 июня 2007 года FDA выпустило «предупреждение об импорте» в отношении выращенной на фермах рыбы и морепродуктов из Китая, поскольку в продукции постоянно обнаруживались несанкционированные антимикробные препараты, включая генциан виолетовый. В отчете FDA говорится:
«Подобно МГ (малахитовому зеленому), КВ (кристаллическому фиолетовому) легко всасывается в ткани рыб при контакте с водой и метаболизируется рыбами до лейко-формы, лейкокристаллического фиолетового (ЛКВ). В нескольких исследованиях Национальной токсикологической программы сообщалось о канцерогенных и мутагенных эффектах кристаллического фиолетового у грызунов. Лейко-форма вызывает опухоли почек, печени и легких у мышей». В 2019 году Health Canada признала медицинские изделия, содержащие генциан виолетовый, безопасными для использования, но рекомендовало прекратить использование всех лекарственных средств, содержащих генциан виолетовый, включая применение на животных, что побудило канадские инженерные школы пересмотреть использование этого красителя в период адаптации первокурсников.