Выделение соединений методом колоночной хроматографии

Введение

Метод выделения соединения из смеси

Колоночная хроматография в химии – это хроматографический метод, используемый для выделения отдельного химического соединения из смеси. Хроматография способна разделять вещества на основе различной адсорбции соединений на адсорбенте; соединения перемещаются по колонке с разной скоростью, что позволяет разделять их на фракции. Метод широко применим, поскольку можно использовать множество различных адсорбентов (нормальной фазы, обратной фазы или иных) с широким спектром растворителей. Метод может применяться в масштабах от микрограммов до килограммов. Основным преимуществом колоночной хроматографии является относительно низкая стоимость и возможность утилизации стационарной фазы, используемой в процессе. Это предотвращает перекрестное загрязнение и деградацию стационарной фазы из-за повторного использования. Колоночную хроматографию можно проводить, используя силу тяжести для перемещения растворителя, или с помощью сжатого газа для проталкивания растворителя через колонку. Тонкослойная хроматография позволяет предсказать поведение смеси соединений при очистке методом колоночной хроматографии. Разделение сначала оптимизируют с помощью тонкослойной хроматографии, после чего проводят колоночную хроматографию.

Подготовка колонны

Колонку готовят, упаковывая твердый адсорбент в цилиндрическую стеклянную или пластиковую трубку. Размер колонки зависит от количества изолируемого вещества. В основании трубки находится фильтр – ватный или стеклянный тампон, либо стеклянная фритта – для удержания твердой фазы. К верхней части колонки может быть присоединен резервуар с растворителем. Для подготовки колонки обычно используют два метода: сухой и влажный. При сухом методе колонку сначала заполняют сухим порошком стационарной фазы, а затем добавляют подвижную фазу, которую пропускают через колонку до полного смачивания, после чего необходимо следить, чтобы она не высыхала. При влажном методе готовят суспензию порошка стационарной фазы в элюенте и аккуратно заливают ее в колонку. Поверхность силикагеля должна быть ровной, и ее можно защитить слоем песка. Элюент медленно пропускают через колонку для продвижения органического материала. Отдельные компоненты по-разному задерживаются стационарной фазой и разделяются друг от друга, двигаясь с разной скоростью в потоке элюента. В конце колонки они элюируются последовательно, один за другим. На протяжении всего процесса хроматографии элюент собирают в серию фракций. Фракции можно собирать автоматически с помощью фракционных коллекторов. Производительность хроматографии можно повысить, одновременно используя несколько колонок. В этом случае применяют коллекторы с мультипоточным сбором. Состав элюента контролируют, и каждую фракцию анализируют на содержание растворенных веществ, например, с помощью аналитической хроматографии, УФ-спектроскопии или флуориметрии. Окрашенные соединения (или флуоресцирующие соединения при использовании УФ-лампы) можно наблюдать как движущиеся полосы через стенку стеклянной колонки.

Стационарная фаза

Стационарная фаза или адсорбент в колоночной хроматографии представляет собой твердое вещество. Наиболее распространенной стационарной фазой для колоночной хроматографии является силикагель, а следующей по распространенности – оксид алюминия (алюмина). В прошлом часто использовался целлюлозный порошок. Широкий спектр стационарных фаз доступен для проведения ионно-обменной хроматографии, обращенно-фазовой хроматографии (RP), аффинной хроматографии или адсорбции в расширенном слое (EBA). Стационарные фазы обычно представляют собой мелкодисперсные порошки или гели и/или имеют микропористую структуру для увеличения площади поверхности, хотя в EBA используется подвижный слой. Существует важное соотношение между массой стационарной фазы и сухой массой смеси анализируемых веществ, которую можно нанести на колонку. Для силикагельной колоночной хроматографии это соотношение составляет от 20:1 до 100:1, в зависимости от того, насколько близко по своим свойствам элюируются компоненты аналита.

Мобильная фаза (элюент)

Подвижная фаза или элюент – это растворитель или смесь растворителей, используемые для перемещения соединений через колонку. Он подбирается таким образом, чтобы значение коэффициента удерживания интересующего соединения было приблизительно 0,2–0,3, чтобы минимизировать время и количество элюента, необходимое для проведения хроматографии. Элюент также выбирают так, чтобы различные соединения могли эффективно разделяться. Оптимизацию элюента проводят в небольших предварительных тестах, часто с использованием тонкослойной хроматографии (ТСХ) с той же стационарной фазой, применяя растворители различной полярности до тех пор, пока не будет найдена подходящая система растворителей. Распространенные растворители подвижной фазы, в порядке возрастания полярности, включают гексан, дихлорметан, этилацетат, ацетон и метанол. Типичная система растворителей – это смесь гексана и этилацетата, с пропорциями, которые регулируются до тех пор, пока целевое соединение не достигнет коэффициента удерживания 0,2–0,3. Вопреки распространенному мнению, метанол можно использовать в качестве элюента для высокополярных соединений, и он не растворяет силикагель. Для каждого конкретного разделения существует оптимальная скорость потока. Более высокая скорость потока элюента минимизирует время, необходимое для проведения хроматографии, и тем самым уменьшает диффузию, что приводит к лучшему разделению. Однако максимальная скорость потока ограничена, поскольку для установления равновесия аналита между стационарной и подвижной фазами требуется конечное время, см. уравнение Ван-Димтера. Простая лабораторная колонка работает за счет силы тяжести. Скорость потока в такой колонке можно увеличить, удлинив заполненную свежим элюентом колонку над верхним слоем стационарной фазы, или уменьшить с помощью регулирующих кранов. Более высокие скорости потока можно достичь с помощью насоса или с помощью сжатого газа (например, воздуха, азота или аргона) для проталкивания растворителя через колонку (хроматография в импульсном режиме). Размер частиц стационарной фазы обычно мельче в хроматографии в импульсном режиме, чем в гравитационной хроматографии. Например, один из наиболее часто используемых марок силикагеля в первой технике – это сетка 230–400 (40–63 мкм), в то время как для второй техники обычно требуется сетка 70–230 (63–200 мкм) силикагеля. Разработана таблица, помогающая в успешной разработке импульсных колонн. В таблице оцениваются объем удерживания и объем зоны аналитов, номера фракций, в которых, как ожидается, будет содержаться каждый аналит, и разрешение между соседними пиками. Эта информация позволяет пользователям выбирать оптимальные параметры для препаративных разделений до проведения хроматографии в импульсном режиме.

The mobile phase or eluent is a solvent or a mixture of solvents used to move the compounds through the column. It is chosen so that the retention factor value of the compound of interest is roughly around 0.2 0.3 in order to minimize the time and the amount of eluent to run the chromatography. The eluent has also been chosen so that the different compounds can be separated effectively. The eluent is optimized in small scale pretests, often using thin layer chromatography (TLC) with the same stationary phase, using solvents of different polarity until a suitable solvent system is found. Common mobile phase solvents, in order of increasing polarity, include hexane, dichloromethane, ethyl acetate, acetone, and methanol. A common solvent system is a mixture of hexane and ethyl acetate, with proportions adjusted until the target compound has a retention factor of 0.2 0.3. Contrary to common misconception, methanol alone can be used as an eluent for highly polar compounds, and does not dissolve silica gel. There is an optimum flow rate for each particular separation. A faster flow rate of the eluent minimizes the time required to run a column and thereby minimizes diffusion, resulting in a better separation. However, the maximum flow rate is limited because a finite time is required for the analyte to equilibrate between the stationary phase and mobile phase, see Van Deemter's equation. A simple laboratory column runs by gravity flow. The flow rate of such a column can be increased by extending the fresh eluent filled column above the top of the stationary phase or decreased by the tap controls. Faster flow rates can be achieved by using a pump or by using compressed gas (e. g. air, nitrogen, or argon) to push the solvent through the column (flash column chromatography). The particle size of the stationary phase is generally finer in flash column chromatography than in gravity column chromatography. For example, one of the most widely used silica gel grades in the former technique is mesh 230 – 400 (40 – 63 μm), while the latter technique typically requires mesh 70 – 230 (63 – 200 μm) silica gel. A spreadsheet that assists in the successful development of flash columns has been developed. The spreadsheet estimates the retention volume and band volume of analytes, the fraction numbers expected to contain each analyte, and the resolution between adjacent peaks. This information allows users to select optimal parameters for preparative scale separations before the flash column itself is attempted.

Автоматизированные системы

Колоночная хроматография – чрезвычайно трудоемкий этап в любой лаборатории и может быстро стать узким местом для любой технологической лаборатории. Многие производители, такие как Biotage, Buchi, Interchim и Teledyne Isco, разработали автоматизированные системы флэш-хроматографии (обычно называемые LPLC, жидкостная хроматография низкого давления), которые минимизируют участие человека в процессе очистки. Автоматизированные системы включают компоненты, обычно встречающиеся в более дорогих системах высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), такие как градиентный насос, порты для ввода образцов, УФ-детектор и фракционный коллектор для сбора элюента. Как правило, эти автоматизированные системы могут разделять образцы от нескольких миллиграммов до промышленных масштабов в несколько килограммов и предлагают гораздо более дешевое и быстрое решение по сравнению с выполнением множественных инъекций на препаративных ВЭЖХ-системах. Разрешающая способность (или способность разделять смесь) в системе LPLC всегда будет ниже, чем в ВЭЖХ, поскольку материал для заполнения колонки ВЭЖХ может быть значительно меньше, обычно всего 5 микрометров, что увеличивает площадь поверхности стационарной фазы, усиливает взаимодействие поверхностей и обеспечивает лучшее разделение. Однако использование этого мелкого материала для заполнения вызывает высокое противодавление, что и обуславливает термин «высокоэффективная жидкостная хроматография». Колонны LPLC обычно заполнены кремнеземом размером около 50 микрометров, что снижает противодавление и разрешающую способность, но также устраняет необходимость в дорогих насосах высокого давления. Производители сейчас начинают переходить к системам флэш-хроматографии с более высоким давлением и обозначают их как системы жидкостной хроматографии среднего давления (MPLC), которые работают при давлении выше .