Разрушение клеток методом шарикового помола.

Введение

Разрушение клеток — это метод или процесс высвобождения биологических молекул из клетки.

Методы

Производство биологически интересных молекул с использованием методов клонирования и культивирования позволяет изучать и производить эти молекулы. За исключением выделяемых молекул, клетки, производящие интересующие молекулы, необходимо разрушать для их извлечения. На этой странице обсуждаются различные методы разрушения клеток. Один из таких методов называется "снятием оболочки" с клеток.

Метод изголовья

В общем лабораторном масштабе механический метод разрушения клеток использует стеклянные, керамические или стальные шарики определённого диаметра, смешанные с образцом, суспендированным в водном растворе. Впервые разработанный Тимом Хопкинсом в конце 1970-х годов, смесь образца и шариков подвергается интенсивной агитации путем перемешивания или встряхивания. Шарики сталкиваются с клеточным образцом, разрушая клетки и высвобождая внутриклеточные компоненты. В отличие от некоторых других методов, механическое сдвиговое воздействие умеренно во время гомогенизации, что обеспечивает получение отличных мембранных или субклеточных препаратов. Этот метод, часто называемый "биение шариками", хорошо подходит для всех типов клеточного материала – от спор до тканей животных и растений. Это наиболее широко используемый метод лизиса дрожжей, позволяющий достичь разрушения более 50% (до 95%). Он имеет преимущество перед другими методами механического разрушения клеток, заключающееся в возможности разрушать очень небольшие объемы образцов, обрабатывать множество образцов одновременно без риска перекрестного загрязнения и отсутствии выделения потенциально опасных аэрозолей в процессе. В простейшем варианте метода равный объем шариков добавляется к клеточной или тканевой суспензии в пробирке, и образец интенсивно перемешивается на обычном лабораторном вортексе. Хотя время обработки относительно велико – в 310 раз больше, чем на специализированных шейкерах, этот метод эффективен для клеток, которые легко разрушаются, и является экономичным. Успешное биение шариками зависит не только от конструктивных особенностей шейкера (учитывающих частоту колебаний, амплитуду колебаний, ориентацию шейкера и пробирок), но и от правильного выбора размера (диаметра) шариков, их состава (стекло, керамика, сталь) и загрузки шариков в пробирку. В большинстве лабораторий биение шариками проводится партиями от одной до двадцати четырех герметичных пластиковых пробирок или центрифужных трубок. Образец и мелкие шарики подвергаются агитации со скоростью около 2000 колебаний в минуту в специально разработанных возвратно-поступательных шейкерах, приводимых в действие мощными электродвигателями. Разрушение клеток завершается за 1–3 минуты встряхивания. Значительно более высокая скорость разрушения клеток достигается с помощью модификации битера с шариками, называемой SoniBeast. В отличие от традиционных машин, она агитирует шарики вихревым движением со скоростью 20 000 колебаний в минуту. Более крупные битеры, вмещающие глубокие лунки микротитровых пластин, также сокращают время обработки, как и диспенсеры для шариков, предназначенные для быстрой загрузки шариков в несколько пробирок или микропластин. Также доступны предварительно загруженные пробирки и микропластины. Все высокоэнергетические битеры нагревают образец примерно на 10 градусов в минуту из-за трения шариков во время гомогенизации. Для предотвращения повреждения термочувствительных белков, таких как ферменты, может потребоваться охлаждение образца во время или после биения шариками. Контроль нагрева образца можно осуществлять путем кратковременного биения шариками с последующим охлаждением на льду, обработкой пробирок в предварительно охлажденных алюминиевых держателях или циркуляцией газообразного хладагента через машину во время биения шариками. Другая конфигурация битера, подходящая для больших объемов образцов, использует вращающийся фторуглеродный ротор внутри камеры объемом 15, 50 или 200 мл для агитации шариков. В этой конфигурации камера может быть окружена статической охлаждающей рубашкой. Используя ту же конфигурацию ротора/камеры, доступны крупные коммерческие машины для обработки многих литров клеточной суспензии. В настоящее время эти машины ограничены обработкой одноклеточных организмов, таких как дрожжи, водоросли и бактерии.

A common laboratory scale mechanical method for cell disruption uses glass, ceramic, or steel beads, in diameter, mixed with a sample suspended in an aqueous solution. First developed by Tim Hopkins in the late 1970s, the sample and bead mix is subjected to high level agitation by stirring or shaking. Beads collide with the cellular sample, cracking open the cell to release the intracellular components. Unlike some other methods, mechanical shear is moderate during homogenization resulting in excellent membrane or subcellular preparations. The method, often called "bead beating", works well for all types of cellular material from spores to animal and plant tissues. It is the most widely used method of yeast lysis, and can yield breakage of well over 50% (up to 95%). It has the advantage over other mechanical cell disruption methods of being able to disrupt very small sample sizes, process many samples at a time with no cross contamination concerns, and does not release potentially harmful aerosols in the process. In the simplest example of the method, an equal volume of beads are added to a cell or tissue suspension in a test tube and the sample is vigorously mixed on a common laboratory vortex mixer. While processing times are slow, taking 310 times longer than that in specialty shaking machines, it works well for easily disrupted cells and is inexpensive. Successful bead beating is dependent not only on design features of the shaking machine (which take into consideration shaking oscillations frequency, shaking throw or distance, shaking orientation and vial orientation), but also the selection of correct bead size ( diameter), bead composition (glass, ceramic, steel) and bead load in the vial. In most laboratories, bead beating is done in batch sizes of one to twenty four sealed, plastic vials or centrifuge tubes. The sample and tiny beads are agitated at about 2000 oscillations per minute in specially designed reciprocating shakers driven by high power electric motors. Cell disruption is complete in 1–3 minutes of shaking. Significantly faster rates of cell disruption are achieved with a bead beater variation called SoniBeast. Differing from conventional machines, it agitates the beads using a vortex motion at 20,000 oscillations per minute. Larger bead beater machines that hold deep well microtiter plates also shorten process times, as do Bead Dispensers designed to quickly load beads into multiple vials or microplates. Pre loaded vials and microplates are also available. All high energy bead beating machines warm the sample about 10 degrees per minute. This is due to frictional collisions of the beads during homogenization. Cooling of the sample during or after bead beating may be necessary to prevent damage to heat sensitive proteins such as enzymes. Sample warming can be controlled by bead beating for short time intervals with cooling on ice between each interval, by processing vials in pre chilled aluminum vial holders or by circulating gaseous coolant through the machine during bead beating. A different bead beater configuration, suitable for larger sample volumes, uses a rotating fluorocarbon rotor inside a 15, 50 or 200 ml chamber to agitate the beads. In this configuration, the chamber can be surrounded by a static cooling jacket. Using this same rotor/chamber configuration, large commercial machines are available to process many liters of cell suspension. Currently, these machines are limited to processing unicellular organisms such as yeast, algae and bacteria.

Криопульверизация

Образцы с жестким внеклеточным матриксом, такие как соединительная ткань животных, некоторые образцы опухолевой биопсии, венозная ткань, хрящ, семена и т. д., измельчаются до мелкого порошка методом ударного измельчения при температуре жидкого азота. Эта техника, известная как криопульверизация, основана на том, что биологические образцы, содержащие значительное количество воды, становятся хрупкими при экстремально низких температурах. Этот метод был впервые описан Смукером и Пфистером в 1975 году, которые называли его крио-воздействием. Авторы показали, что клетки эффективно разрушаются этим методом, что подтверждено фазовой и электронной микроскопией – плоскости разрушения проходят сквозь клеточные стенки и цитоплазматические мембраны. Технику можно проводить с использованием ступки и пестика, охлажденных до температуры жидкого азота, однако использование этого классического оборудования трудоемко и часто вызывает опасения по поводу потери образца. Для этой цели также доступны специализированные пульверизаторы из нержавеющей стали, обычно называемые пульверизаторами тканей. Они требуют меньше ручного труда, обеспечивают хороший выход образца и легко очищаются между образцами. Преимущества этой методики заключаются в более высоком выходе белков и нуклеиновых кислот из небольших, твердых образцов ткани, особенно при использовании в качестве предварительного этапа к механическим или химическим/растворительным методам разрушения клеток, упомянутым выше.

Высокодавление клеток нарушения

С 1940-х годов высокое давление используется как метод разрушения клеток, наиболее известным примером является французский пресс для клеток, или просто французский пресс. Этот метод был разработан Чарльзом Стейси Френчем и использует высокое давление для проталкивания клеток через узкое отверстие, вызывая лизис клеток из-за сил сдвига, возникающих при разнице давлений. Несмотря на то, что французские прессы стали неотъемлемой частью многих микробиологических лабораторий, их производство в значительной степени прекращено, что привело к возрождению интереса к альтернативным применениям аналогичных технологий. Современные физические разрушители клеток обычно работают за счет пневматического или гидравлического давления. Хотя пневматические установки обычно дешевле, их производительность может быть нестабильной из-за колебаний рабочего давления в течение хода воздушного насоса. Обычно считается, что гидравлические установки обеспечивают более эффективный лизис, особенно при обработке трудноразрушаемых образцов, таких как дрожжи или грамположительные бактерии, благодаря их способности поддерживать постоянное давление на протяжении всего хода поршня. Поскольку французский пресс, работающий под гидравлическим давлением, способен обеспечить лизис более 90% наиболее часто используемых типов клеток, он часто рассматривается как золотой стандарт эффективности лизиса, и современные установки часто сравниваются с ним не только по эффективности лизиса, но и по безопасности и простоте использования. Некоторые производители также стремятся улучшить традиционную конструкцию, изменяя параметры этих установок, помимо давления, проталкивающего образец через отверстие. Одним из таких примеров является компания Constant Systems, которая недавно продемонстрировала, что их разрушители клеток не только соответствуют производительности традиционного французского пресса, но и стремятся достичь тех же результатов при значительно меньшей мощности. Технология циклического давления (PCT). PCT – запатентованная технологическая платформа, использующая чередующиеся циклы гидростатического давления между атмосферным и ультравысоким (до 90 000 psi) для безопасного, удобного и воспроизводимого контроля над действием молекул в биологических образцах, например, для разрыва (лизиса) клеток и тканей из человеческих, животных, растительных и микробных источников, а также для инактивации патогенов. Системы, усовершенствованные с помощью PCT (приборы и расходные материалы), решают некоторые сложные проблемы, связанные с подготовкой биологических образцов. Преимущества PCT включают: (a) экстракцию и восстановление большего количества мембранных белков, (b) усиленное протеолитическое расщепление, (c) дифференциальный лизис в смешанной матрице образца, (d) инактивацию патогенов, (e) повышение чувствительности обнаружения ДНК и (f) превосходный контроль процесса подготовки образцов. Метод микрофлюидизации, используемый для разрушения клеток, оказывает значительное влияние на физико-химические свойства лизированной клеточной суспензии, такие как размер частиц, вязкость, выход белка и активность ферментов. В последние годы метод микрофлюидизации приобрел популярность благодаря простоте использования и эффективности разрушения различных типов клеток. Технология микрофлюидизатора была лицензирована у компании Arthur D. Little и впервые была разработана и применена в 1980-х годах, изначально как инструмент для создания липосом. С тех пор она используется и в других областях, таких как разрушение клеток для получения наноэмульсий и уменьшение размера твердых частиц. Используя микроканалы с фиксированной геометрией и интенсификаторный насос, генерируются высокие скорости сдвига, которые разрушают клетки. Этот метод лизиса может приводить к разрушению более 90% клеток E. coli. Многие белки чрезвычайно чувствительны к температуре и во многих случаях могут начать денатурироваться уже при 4°C. Внутри микроканалов температура превышает 4°C, но конструкция установки обеспечивает быстрое охлаждение, так что время воздействия клеток на повышенные температуры крайне мало (время пребывания 25–40 мс). Благодаря такому эффективному контролю температуры микрофлюидизатор обеспечивает более высокий уровень активных белков и ферментов, чем другие механические методы, при работе с термочувствительными белками. При разрушении клеток часто наблюдаются изменения вязкости. Если вязкость клеточной суспензии высока, это может затруднить последующую обработку, такую как фильтрация и точное пипетирование. Изменения вязкости, наблюдаемые при использовании микрофлюидизатора, относительно невелики и уменьшаются при повторных проходах через установку. В отличие от других методов механического разрушения, микрофлюидизатор эффективно, но бережно разрушает клеточные мембраны, что приводит к образованию относительно крупных фрагментов клеточной стенки (450 нм), что облегчает отделение клеточного содержимого. Это может привести к сокращению времени фильтрации и улучшению разделения при центрифугировании. Технология микрофлюидизации масштабируется от одного миллилитра до тысяч литров.

Since the 1940s high pressure has been used as a method of cell disruption, most notably by the French Pressure Cell Press, or French Press for short. This method was developed by Charles Stacy French and utilises high pressure to force cells through a narrow orifice, causing the cells to lyse due to the shear forces experienced across the pressure differential. While French Presses have become a staple item in many microbiology laboratories, their production has been largely discontinued, leading to a resurgence in alternate applications of similar technology. Modern physical cell disruptors typically operate via either pneumatic or hydraulic pressure. Although pneumatic machines are typically lower cost, their performance can be unreliable due to variations in the processing pressure throughout the stroke of the air pump. It is generally considered that hydraulic machines offer superior lysing ability, especially when processing harder to break samples such as yeast or Gram positive bacteria, due to their ability to maintain constant pressure throughout the piston stroke. As the French Press, which is operated by hydraulic pressure, is capable of over 90% lysis of most commonly used cell types it is often taken as the gold standard in lysis performance and modern machines are often compared against it not only in terms of lysis efficiency but also in terms of safety and ease of use. Some manufacturers are also trying to improve on the traditional design by altering properties within these machines other than the pressure driving the sample through the orifice. One such example is Constant Systems, who have recently shown that their Cell Disruptors not only match the performance of a traditional French Press, but also that they are striving towards attaining the same results at a much lower power. Pressure Cycling Technology ("PCT"). PCT is a patented, enabling technology platform that uses alternating cycles of hydrostatic pressure between ambient and ultra high levels (up to 90,000 psi) to safely, conveniently and reproducibly control the actions of molecules in biological samples, e. g., the rupture (lysis) of cells and tissues from human, animal, plant, and microbial sources, and the inactivation of pathogens. PCT enhanced systems (instruments and consumables) address some challenging problems inherent in biological sample preparation. PCT advantages include: (a) extraction and recovery of more membrane proteins, (b) enhanced protein digestion, (c) differential lysis in a mixed sample base, (d) pathogen inactivation, (e) increased DNA detection, and (f) exquisite sample preparation process control. The Microfluidizer method used for cell disruption strongly influences the physicochemical properties of the lysed cell suspension, such as particle size, viscosity, protein yield and enzyme activity. In recent years the Microfluidizer method has gained popularity in cell disruption due to its ease of use and efficiency at disrupting many different kinds of cells. The Microfluidizer technology was licensed from a company called Arthur D. Little and was first developed and utilized in the 1980s, initially starting as a tool for liposome creation. It has since been used in other applications such as cell disruption nanoemulsions, and solid particle size reduction, among others. By using microchannels with fixed geometry, and an intensifier pump, high shear rates are generated that rupture the cells. This method of cell lysis can yield breakage of over 90% of E. coli cells. Many proteins are extremely temperature sensitive, and in many cases can start to denature at temperatures of only 4 degrees celsius. Within the microchannels, temperatures exceed 4 degrees celsius, but the machine is designed to cool quickly so that the time the cells are exposed to elevated temperatures is extremely short (residence time 25 ms 40 ms). Because of this effective temperature control, the Microfluidizer yields higher levels of active proteins and enzymes than other mechanical methods when the proteins are temperature sensitive. Viscosity changes are also often observed when disrupting cells. If the cell suspension viscosity is high, it can make downstream handling—such as filtration and accurate pipetting—quite difficult. The viscosity changes observed with a Microfluidizer are relatively low, and decreases with further additional passes through the machine. In contrast to other mechanical disruption methods the Microfluidizer breaks the cell membranes efficiently but gently, resulting in relatively large cell wall fragments (450 nm), and thus making it easier to separate the cell contents. This can lead to shorter filtration times and better centrifugation separation. Microfluidizer technology scales from one milliliter to thousands of liters.

Декомпрессия азота

Для декомпрессии азота большое количество азота сначала растворяется в клетках под высоким давлением в подходящем сосуде высокого давления. Затем, при резком снижении давления газа, азот выходит из раствора в виде расширяющихся пузырьков, которые растягивают мембраны каждой клетки до разрыва и высвобождения содержимого. Декомпрессия азота обеспечивает лучшую защиту ферментов и органелл по сравнению с ультразвуковыми и механическими методами гомогенизации и сопоставима по эффективности с контролируемым разрушением, достигаемым в гомогенизаторе с пестиком и ступкой из PTFE и стекла. В то время как другие методы разрушения основаны на трении или механическом сдвиге, приводящих к нагреву, процедура декомпрессии азота сопровождается адиабатическим расширением, которое охлаждает образец вместо нагрева. Окружение из инертного азота, насыщающего суспензию клеток и гомогенат, обеспечивает защиту клеточных компонентов от окисления. Хотя в этой технике использовались и другие газы, такие как диоксид углерода, закись азота, оксид углерода и сжатый воздух, азот предпочтителен из-за своей химической инертности и отсутствия влияния на pH среды. Кроме того, азот предпочтителен благодаря его доступности по низкой цене и подходящему для этой процедуры давлению. После высвобождения субклеточные компоненты не подвергаются дальнейшему измельчению, которое могло бы привести к денатурации образца или нежелательному повреждению. Нет необходимости искать пик между ферментативной активностью и степенью разрушения. Поскольку пузырьки азота образуются внутри каждой клетки, разрушающее воздействие прикладывается равномерно ко всему образцу, обеспечивая исключительную однородность продукта. Можно получить гомогенаты, свободные от клеток. Метод используется для гомогенизации клеток и тканей, высвобождения неповрежденных органелл, подготовки клеточных мембран, высвобождения лабильных биохимических веществ и получения однородных и воспроизводимых гомогенатов без воздействия на образец экстремальных химических или физических нагрузок. Метод особенно хорошо подходит для обработки клеток млекопитающих и других клеток, связанных с мембраной. Он также успешно применяется для обработки растительных клеток, выделения вирусов из оплодотворенных яйцеклеток и обработки хрупких бактерий. Не рекомендуется использовать его для необработанных бактериальных клеток. Дрожжи, грибы, споры и другие материалы с прочными клеточными стенками плохо поддаются этому методу.

For nitrogen decompression, large quantities of nitrogen are first dissolved in the cell under high pressure within a suitable pressure vessel. Then, when the gas pressure is suddenly released, the nitrogen comes out of the solution as expanding bubbles that stretch the membranes of each cell until they rupture and release the contents of the cell. Nitrogen decompression is more protective of enzymes and organelles than ultrasonic and mechanical homogenizing methods and compares favorably to the controlled disruptive action obtained in a PTFE and glass mortar and pestle homogenizer. While other disruptive methods depend upon friction or a mechanical shearing action that generate heat, the nitrogen decompression procedure is accompanied by an adiabatic expansion that cools the sample instead of heating it. The blanket of inert nitrogen gas that saturates the cell suspension and the homogenate offers protection against oxidation of cell components. Although other gases: carbon dioxide, nitrous oxide, carbon monoxide and compressed air have been used in this technique, nitrogen is preferred because of its non reactive nature and because it does not alter the pH of the suspending medium. In addition, nitrogen is preferred because it is generally available at low cost and at pressures suitable for this procedure. Once released, subcellular substances are not exposed to continued attrition that might denature the sample or produce unwanted damage. There is no need to watch for a peak between enzyme activity and percent disruption. Since nitrogen bubbles are generated within each cell, the same disruptive force is applied uniformly throughout the sample, thus ensuring unusual uniformity in the product. Cell free homogenates can be produced. The technique is used to homogenize cells and tissues, release intact organelles, prepare cell membranes, release labile biochemicals, and produce uniform and repeatable homogenates without subjecting the sample to extreme chemical or physical stress. The method is particularly well suited for treating mammalian and other membrane bound cells. It has also been used successfully for treating plant cells, for releasing virus from fertilized eggs and for treating fragile bacteria. It is not recommended for untreated bacterial cells. Yeast, fungus, spores and other materials with tough cell walls do not respond well to this method.