Стрептавидин из Streptomyces avidinii: структура и свойства связывания с биотином

Введение

Белок Streptomyces avidinii

Стрептавидин, /s/t/r/e/p/'t/æ/v/ɪ/d/ɪ/n/ – это 52 кДа белок (тетрамер), выделенный из бактерии Streptomyces avidinii. Гомотетрамеры стрептавидина обладают исключительно высоким сродством к биотину (также известному как витамин B7 или витамин H). Благодаря константе диссоциации (Kd) порядка ≈10−14 моль/л, связывание биотина со стрептавидином является одним из самых прочных нековалентных взаимодействий, известных в природе. Стрептавидин широко используется в молекулярной биологии и бионанотехнологии благодаря устойчивости комплекса стрептавидин-биотин к органическим растворителям, денатурантам (например, хлориду гуанидина), детергентам (например, SDS, Triton X 100), протеолитическим ферментам, а также к экстремальным температурам и значениям pH.

Структура

В 1989 году две группы исследователей сообщили о кристаллической структуре стрептавидина, связанного с биотином. Структура была определена с использованием аномальной дифракции на нескольких длинах волн группой Хендриксона и др. в Колумбийском университете и с использованием множественной изоморфной замены группой Вебера и др. в Центральном отделе исследований и разработок E. I. DuPont. По состоянию на сентябрь 2017 года в Банке данных белков (Protein Data Bank) размещено 171 структура. Полный список доступен по этой ссылке. N- и C-концы полноразмерного белка, состоящего из 159 аминокислотных остатков, подвергаются процессингу для получения более короткого «основного» стрептавидина, обычно состоящего из остатков 13–139; удаление N- и C-концов необходимо для достижения максимального сродства к биотину. Вторичная структура мономера стрептавидина состоит из восьми антипараллельных β-нитей, которые сворачиваются, образуя третичную структуру в виде антипараллельного β-цилиндра. Место связывания биотина расположено на одном конце каждого β-цилиндра. Четыре идентичных мономера стрептавидина (то есть четыре идентичных β-цилиндра) объединяются, образуя тетрамерную четвертичную структуру стрептавидина. Место связывания биотина в каждом цилиндре состоит из остатков, расположенных внутри цилиндра, а также из консервативной Trp120 из соседней субъединицы. Таким образом, каждая субъединица вносит вклад в место связывания на соседней субъединице, и поэтому тетрамер можно рассматривать как димер функциональных димеров.

Истоки высокой аффинитета

Многочисленные кристаллические структуры комплекса стрептавидина с биотином пролили свет на происхождение его замечательной аффинности. Во-первых, наблюдается высокая степень комплементарности по форме между связывающим карманом и биотином. Во-вторых, при связывании биотина в кармане формируется обширная сеть водородных связей. В связывающем кармане (так называемая "первая оболочка" водородных связей) непосредственно с остатками образуется восемь водородных связей, с участием остатков Asn23, Tyr43, Ser27, Ser45, Asn49, Ser88, Thr90 и Asp128. Существует также "вторая оболочка" водородных связей, включающая остатки, взаимодействующие с остатками первой оболочки. Однако аффинность стрептавидина к биотину превышает ту, которую можно было бы предсказать, основываясь только на водородных связях, что указывает на наличие другого механизма, способствующего высокой аффинности. Связывающий карман для биотина гидрофобен, и при связывании биотина в кармане образуется множество контактов, опосредованных силами Ван-дер-Ваальса и гидрофобными взаимодействиями, что также считается важным фактором, определяющим высокую аффинность. В частности, стенки кармана выстланы консервативными остатками триптофана. Наконец, связывание биотина сопровождается стабилизацией гибкой петли, соединяющей β-цепи 3 и 4 (L3/4), которая закрывается над связанным биотином, подобно "крышке" над связывающим карманом, и способствует чрезвычайно медленной скорости диссоциации биотина. Большинство попыток мутации стрептавидина приводят к снижению аффинности связывания с биотином, что ожидаемо в такой высокооптимизированной системе. Однако недавно разработанный мутант стрептавидина, названный траптавидином, показал более чем десятикратное снижение скорости диссоциации биотина, а также повышенную термическую и механическую стабильность. Это снижение скорости диссоциации сопровождалось двукратным снижением скорости ассоциации. Аффинность связывания биотина может быть снижена химической модификацией стрептавидина, например, с использованием аминореактивных флюорофоров; флавидин – это мутант стрептавидина, лишенный боковых цепей лизина, который сохраняет хорошие характеристики связывания с биотином после такой флуоресцентной маркировки, когда краситель присоединяется к аминоконцу.

The numerous crystal structures of the streptavidin biotin complex have shed light on the origins of the remarkable affinity. Firstly, there is high shape complementarity between the binding pocket and biotin. Secondly, there is an extensive network of hydrogen bonds formed to biotin when in the binding site. There are eight hydrogen bonds directly made to residues in the binding site (the so called 'first shell' of hydrogen bonding), involving residues Asn23, Tyr43, Ser27, Ser45, Asn49, Ser88, Thr90 and Asp128. There is also a 'second shell' of hydrogen bonding involving residues that interact with the first shell residues. However, the streptavidin biotin affinity exceeds that which would be predicted from the hydrogen bonding interactions alone, suggesting another mechanism contributing to the high affinity. The biotin binding pocket is hydrophobic, and there are numerous van der Waals force mediated contacts and hydrophobic interactions made to the biotin when in the pocket, which is also thought to account for the high affinity. In particular, the pocket is lined with conserved tryptophan residues. Lastly, biotin binding is accompanied by the stabilisation of a flexible loop connecting β strands 3 and 4 (L3/4), which closes over the bound biotin, acting like a 'lid' over the binding pocket and contributing to the extremely slow biotin dissociation rate. Most attempts at mutating streptavidin result in a lowered biotin binding affinity, which is to be expected in such a highly optimized system. However, a recently engineered mutant of streptavidin, named traptavidin, was found to have more than ten fold slower biotin dissociation, in addition to higher thermal and mechanical stability. This decreased dissociation rate was accompanied by a two fold decrease in the association rate. Biotin binding affinity can be impaired by chemical labeling of streptavidin, such as with amine reactive fluorophores; flavidin is a streptavidin mutant without lysine side chains, which retains good biotin binding characteristics after such fluorescent dye labeling where the dye couples to the amino terminus.

Сравнение с авидином

Стрептавидин – не единственный белок, способный связываться с биотином с высокой аффинностью. Авидин – другой наиболее известный белок, связывающий биотин. Изначально выделенный из яичного желтка, авидин имеет всего 30% идентичности последовательности аминокислот со стрептавидином, но почти идентичную вторичную, третичную и четвертичную структуру. Авидин обладает более высоким сродством к биотину (Kd ~ 10−15M), но, в отличие от стрептавидина, он гликозилирован, положительно заряжен, проявляет псевдокаталитическую активность (авидин может усиливать щелочной гидролиз эфирной связи между биотином и нитрофенильной группой) и имеет большую склонность к агрегации. С другой стороны, стрептавидин лучше связывает биотиновые конъюгаты; авидин демонстрирует более низкое сродство к биотину, когда он конъюгирован с другой молекулой, несмотря на более высокое сродство к свободному, неконъюгированному биотину. Поскольку стрептавидин не содержит углеводных модификаций и имеет близкий к нейтральному pI, он обладает преимуществом значительно более низкой неспецифической связки, чем авидин. Дегликозилированный авидин (NeutrAvidin) по своим характеристикам – размеру, pI и неспецифической связке – более сопоставим со стрептавидином.