Введение

Ферменты, участвующие в эксцизионной репарации оснований.
ДНК-гликозилазы – это семейство ферментов, участвующих в эксцизионной репарации оснований, классифицированных под номером EC 3.2.2. Эксцизионная репарация оснований – это механизм, посредством которого поврежденные основания в ДНК удаляются и заменяются. ДНК-гликозилазы катализируют первый этап этого процесса. Они удаляют поврежденное азотистое основание, оставляя неповрежденной сахарно-фосфатную цепь, создавая апуриновый/апиримидиновый участок, обычно называемый AP-участком. Это достигается путем извлечения поврежденного основания из двойной спирали с последующим расщеплением N-гликозидной связи. Гликозилазы были впервые обнаружены у бактерий, а затем найдены во всех царствах живых организмов. Помимо своей роли в эксцизионной репарации оснований, ферменты ДНК-гликозилазы были вовлечены в подавление репрессии генов у *A. thaliana*, *N. tabacum* и других растений посредством активного деметилирования. 5-метилцитозиновые остатки удаляются и заменяются неметилированными цитозинами, обеспечивая доступ к хроматиновой структуре ферментов и белков, необходимых для транскрипции и последующей трансляции.

Монофункциональные и бифункциональные гликозилазы

Существует два основных класса гликозилаз: монофункциональные и бифункциональные. Монофункциональные гликозилазы обладают только гликозилазной активностью, в то время как бифункциональные гликозилазы также обладают активностью АП-лиазы, позволяющей им разрывать фосфодиэфирную связь ДНК, создавая одноцепочечный разрыв без необходимости в АП-эндонуклеазе. β-Элиминация АП-сайта гликозилазной лиазой приводит к образованию 3'-α,β-ненасыщенного альдегида, соседствующего с 5'-фосфатом, что отличается от продукта расщепления АП-эндонуклеазой. Некоторые гликозилазные лиазы могут дополнительно осуществлять δ-элиминацию, которая превращает 3'-альдегид в 3'-фосфат.

Биохимический механизм

Первая кристаллическая структура ДНК-гликозилазы была получена для E. coli Nth. Эта структура показала, что фермент выводит поврежденное основание из двойной спирали в активный карман для его удаления. С тех пор было обнаружено, что другие гликозилазы следуют той же общей схеме, включая человеческий UNG, изображенный ниже. Для разрыва N-гликозидной связи монофункциональные гликозилазы используют активированную молекулу воды для атаки первого атома углерода субстрата. Бифункциональные гликозилазы, напротив, используют аминокислотный остаток в качестве нуклеофила для атаки того же атома углерода, образуя промежуточное соединение – основание Шиффа.

Гликозилязы ДНК урацила

В молекулярной биологии семейство белков урацил-ДНК-гликозилаза (UDG) представляет собой фермент, восстанавливающий мутации в ДНК. Наиболее распространенной мутацией является деаминирование цитозина в урацил. UDG исправляет эти мутации. UDG имеет решающее значение для репарации ДНК, без него эти мутации могут приводить к раку. Данная запись представляет различные урацил-ДНК-гликозилазы и связанные с ними ДНК-гликозилазы (EC), такие как урацил-ДНК-гликозилаза, термофильная урацил-ДНК-гликозилаза, G:T/U-специфичная ДНК-гликозилаза (Mug) и одноцепочечно-селективная монофункциональная урацил-ДНК-гликозилаза (SMUG1). Урацил-ДНК-гликозилазы удаляют урацил из ДНК, который может возникать либо в результате спонтанного деаминирования цитозина, либо в результате ошибочного включения dU напротив dA во время репликации ДНК. Прототипичным членом этого семейства является UDG из E. coli, которая была одной из первых обнаруженных гликозилаз. В клетках млекопитающих идентифицированы четыре различных типа активности урацил-ДНК-гликозилазы, включая UNG, SMUG1, TDG и MBD4. Они различаются по специфичности к субстрату и субклеточной локализации. SMUG1 предпочитает одноцепочечную ДНК в качестве субстрата, но также удаляет U из двухцепочечной ДНК. Помимо немодифицированного урацила, SMUG1 может вырезать 5-гидроксиурацил, 5-гидроксиметилурацил и 5-формалурацил, несущие окисленную группу в положении C5 кольца. TDG и MBD4 строго специфичны к двухцепочечной ДНК. TDG может удалять тимингликоль при его наличии напротив гуанина, а также производные U с модификациями в положении 5. Современные данные свидетельствуют о том, что в клетках человека TDG и SMUG1 являются основными ферментами, ответственными за репарацию U:G-несоответствий, вызванных спонтанным деаминированием цитозина, в то время как урацил, возникающий в ДНК в результате ошибочного включения dU, в основном обрабатывается UNG. MBD4 предположительно корректирует T:G-несоответствия, возникающие в результате деаминирования 5-метилцитозина в тимин в CpG-сайтах. Мыши с мутациями в гене MBD4 развиваются нормально и не проявляют повышенной восприимчивости к раку или сниженной выживаемости. Однако у них накапливается больше C-T мутаций в CpG-последовательностях в эпителиальных клетках тонкой кишки. Структура человеческого UNG в комплексе с ДНК показала, что, как и другие гликозилазы, он выводит целевой нуклеотид из двойной спирали в активный карман. UDG претерпевает конформационное изменение из «открытого» несвязанного состояния в «закрытое» состояние, связанное с ДНК.

История

Линдаль первым обнаружил восстановление урацила в ДНК. UDG был очищен из Escherichia coli и гидролизовал N-гликозидную связь, соединяющую основание с дезоксирибозным сахаром в составе ДНК-остова. Эти аберрантные остатки урацила генотоксичны.

Локализация

В эукариотических клетках активность UNG обнаруживается как в ядре, так и в митохондриях. Белок UNG1 человека транспортируется как в митохондрии, так и в ядро.

Сохранение

Последовательность урациловой ДНК-гликозилазы чрезвычайно хорошо сохранена у бактерий и эукариот, а также у вирусов герпеса. Более далёко родственные урациловые ДНК-гликозилазы также встречаются у поксвирусов. Кажется, что N-концевые 77 аминокислот UNG1 необходимы для митохондриальной локализации, однако наличие митохондриального транзитного пептида не было непосредственно продемонстрировано. Наиболее консервативный N-концевой участок содержит остаток аспарагиновой кислоты, который, согласно данным рентгеноструктурного анализа, предположительно действует как общий протонный акцептор в каталитическом механизме.

Семья

Существует две семьи UDG, названные Семья 1 и Семья 2. Семья 1 активна против урацила в одноцепочечной (ssDNA) и двухцепочечной (dsDNA) ДНК. Семья 2 удаляет урацил из неспаренных оснований с гуанином. Аналогичный фенотип наблюдается при инактивации MYH, но одновременная инактивация MYH и OGG1 приводит к накоплению 8-оксо-гуанина в различных тканях, включая легкие и тонкий кишечник. У людей мутации в гене MYH ассоциированы с повышенным риском развития полипов толстой кишки и рака толстой кишки. Помимо OGG1 и MYH, клетки человека содержат три дополнительные ДНК-гликозилазы: NEIL1, NEIL2 и NEIL3. Они гомологичны бактериальной Nei, и их присутствие, вероятно, объясняет умеренные фенотипы мышей с нокаутом по генам OGG1 и MYH.

Гликозилазы алкилированных оснований

Эта группа включает E. coli AlkA и родственные белки у высших эукариот. Эти гликозилазы монофункциональны и распознают метилированные основания, такие как 3-метиладенин.

Алка

AlkA относится к ДНК-гликозилазе II, специфичной к 3-метиладенину.

Патология

Гликозилазы ДНК, участвующие в репарации оснований путем удаления (BER), могут быть ассоциированы с риском рака у носителей мутаций BRCA1 и BRCA2.

Эпигенетические дефициты при раковых заболеваниях

Эпигенетические изменения (эпимутации) в генах ДНК-гликозилаз только недавно начали изучаться в нескольких типах рака, в отличие от многочисленных предыдущих исследований эпимутаций в генах, участвующих в других путях репарации ДНК (например, MLH1 в системе репарации неспаренных оснований и MGMT в прямом восстановлении). Ниже приведены два примера эпимутаций в генах ДНК-гликозилаз, наблюдаемых при раке.

MBD4

MBD4 (протеин с метил-CpG-связывающим доменом 4) — это гликозилаза, используемая на начальной стадии репарации вырезания основания. Белок MBD4 предпочтительно связывается с полностью метилированными CpG-сайтами. Эти измененные основания образуются в результате частого гидролиза цитозина до урацила (см. рисунок) и гидролиза 5-метилцитозина до тимина, что приводит к образованию пар оснований G:U и G:T. Если эти неправильные урацилы или тимины в этих парах оснований не удаляются до репликации ДНК, они вызывают транзиционные мутации. MBD4 специфически катализирует удаление T и U, спаренных с гуанином (G) в CpG-сайтах. Это важная функция репарации, поскольку около 1/3 всех внутригенных мутаций в одной паре оснований при раке человека происходит в CpG-динуклеотидах и является результатом переходов G:C в A:T. Эти переходы составляют наиболее частые мутации при раке человека. Например, почти 50% соматических мутаций гена-супрессора опухолей p53 при колоректальном раке — это переходы G:C в A:T в пределах CpG-сайтов. Кроме того, MBD4 дефицитен из-за мутаций примерно в 4% случаев колоректального рака.

Большинство гистологически нормальных участков, окружающих новообразования (аденомы и рак толстой кишки) в толстой кишке, также демонстрируют снижение экспрессии мРНК MBD4 (полевой дефект) по сравнению с гистологически нормальной тканью у людей, у которых никогда не было новообразований толстой кишки.

Нейл1

Nei like (NEIL) 1 – это ДНК-гликозилаза семейства Nei (которое также включает NEIL2 и NEIL3). NEIL1 является компонентом комплекса репликации ДНК, необходимого для контроля окисленных оснований перед репликацией, и, по-видимому, действует как своего рода "затормозитель", замедляя репликацию до тех пор, пока NEIL1 не сможет функционировать как гликозилаза и удалить окислительно поврежденное основание. Лучшими субстратами для NEIL1 человека, по всей видимости, являются поражения гидантоинового типа, гуанидиногидантоин и спироиминодигидантоин, являющиеся продуктами дальнейшего окисления 8-оксоG. NEIL1 также способен удалять повреждения из одноцепочечной ДНК, а также из структур ДНК в виде "пузырей" и развилок. Дефицит NEIL1 приводит к увеличению мутагенеза в месте пары 8-оксо-Gua:C, при этом большинство мутаций представляют собой G:C – T:A трансверсии. Исследование 2004 года показало, что у 46% пациентов с первичным раком желудка наблюдалось снижение экспрессии мРНК NEIL1, хотя механизм этого снижения оставался неизвестным. В этом же исследовании было обнаружено, что у 4% пациентов с раком желудка имеются мутации в гене NEIL1. Авторы предположили, что низкая активность NEIL1, возникающая в результате снижения экспрессии и/или мутации гена NEIL1, часто вовлечена в канцерогенез желудка. Был проведен скрининг 145 генов репарации ДНК на предмет аберрантного метилирования промотора в тканях плоскоклеточной карциномы головы и шеи (HNSCC), полученных от 20 пациентов, а также в образцах слизистой оболочки головы и шеи от 5 пациентов, не страдающих раком. Этот скрининг показал, что ген NEIL1 демонстрирует значительно повышенное гиперметилирование, и из 145 исследованных генов репарации ДНК именно у NEIL1 была наиболее значимая разница в частоте метилирования. Более того, гиперметилирование соответствовало снижению экспрессии мРНК NEIL1. Дальнейшие исследования с использованием 135 образцов опухолей и 38 образцов нормальных тканей также показали, что у 71% образцов тканей HNSCC наблюдалось повышенное метилирование промотора NEIL1. Это была наиболее часто встречающаяся аномалия репарации ДНК среди 8 протестированных генов репарации ДНК. NEIL1 также был одним из шести генов репарации ДНК, обнаруженных с гиперметилированием в промоторных областях при колоректальном раке.