Введение

Путь, восстанавливающий двойные разрывы ДНК

Негомологичное соединение концов (NHEJ) — это путь, восстанавливающий двойные разрывы ДНК. Он называется «негомологичным», поскольку концы разрыва непосредственно соединяются без необходимости в гомологичном матрице, в отличие от репарации, направляемой гомологией (HDR), для которой требуется гомологичная последовательность в качестве шаблона для восстановления. NHEJ активен как в неделящихся, так и в пролиферирующих клетках, в то время как HDR не всегда доступен в неделящихся клетках. Термин «негомологичное соединение концов» был введен в 1996 году Муром и Хабером. NHEJ обычно направляется короткими гомологичными последовательностями ДНК, называемыми микрогомологиями. Эти микрогомологии часто присутствуют в одноцепочечных выступах на концах двойных разрывов. Когда выступы идеально совместимы, NHEJ обычно восстанавливает разрыв точно. Возможен также неточный ремонт, приводящий к потере нуклеотидов, но он гораздо более распространен, когда выступы несовместимы. Неправильный NHEJ может приводить к транслокациям и слиянию теломер – характерным признакам опухолевых клеток. Считается, что механизмы NHEJ существуют практически во всех биологических системах, и это основной путь восстановления двойных разрывов в клетках млекопитающих. Однако у пивных дрожжей (Saccharomyces cerevisiae) гомологичная рекомбинация преобладает при культивировании в обычных лабораторных условиях. При инактивации пути NHEJ двойные разрывы могут восстанавливаться более подверженным ошибкам путем, называемым соединением концов, опосредованным микрогомологиями (MMEJ). В этом пути концевая резекция выявляет короткие микрогомологии по обе стороны от разрыва, которые затем выравниваются для направления восстановления. Это отличается от классического NHEJ, который обычно использует микрогомологии, уже присутствующие в одноцепочечных выступах на концах разрыва. Таким образом, восстановление посредством MMEJ приводит к удалению последовательности ДНК между микрогомологиями.

и археи

Многие виды бактерий, включая Escherichia coli, не имеют пути соединения концов и поэтому полностью полагаются на гомологичную рекомбинацию для восстановления двойных разрывов ДНК. Белки NHEJ были идентифицированы у ряда бактерий, включая Bacillus subtilis, Mycobacterium tuberculosis и Mycobacterium smegmatis. Бактерии используют удивительно компактную версию NHEJ, в которой все необходимые функции заключены всего в двух белках: Ku-гомодимере и многофункциональной лигазе/полимеразе/нуклеазе LigD. У микобактерий NHEJ гораздо более подвержен ошибкам, чем у дрожжей, при этом основания часто добавляются к концам двойных разрывов и удаляются из них в процессе восстановления. Археальная система NHEJ у Methanocella paludicola содержит Ku-гомодимер, но три функции LigD разделены на три белка с одним доменом, объединенных в оперон. Все три гена сохраняют значительную гомологию со своими аналогами LigD, а полимераза сохраняет предпочтение к rNTP. NHEJ многократно терялся и приобретался бактериями и археями, при этом значительное количество горизонтального переноса генов перемешивало систему между таксонами. Corndog и Omega, два родственных микобактериофага Mycobacterium smegmatis, также кодируют гомологи Ku и используют путь NHEJ для рециркуляризации своих геномов во время инфекции. В отличие от гомологичной рекомбинации, которая была широко изучена у бактерий, NHEJ первоначально была обнаружена у эукариот и была идентифицирована у прокариот только в последнее десятилетие.

Окончание связывания и привязки

В дрожжах комплекс Mre11 Rad50 Xrs2 (MRX) рекрутируется к DSB на ранней стадии и, как считается, способствует сближению концов ДНК. Соответствующий комплекс млекопитающих Mre11 Rad50 Nbs1 (MRN) также участвует в NHEJ, но может функционировать на нескольких этапах этого пути, а не только поддерживая концы ДНК в непосредственной близости. Также предполагается, что ДНК PKcs участвует в образовании моста между концами ДНК во время NHEJ у млекопитающих. Еukaryotic Ku – это гетеродимер, состоящий из Ku70 и Ku80, который образует комплекс с ДНК PKcs, присутствующий у млекопитающих, но отсутствующий у дрожжей. Ku имеет форму корзины, скользит на конец ДНК и перемещается внутрь. Ku может служить платформой для дока других белков NHEJ и известно, что он взаимодействует с комплексом ДНК-лигазы IV и XLF.

Конечная обработка

Конечная обработка включает удаление поврежденных или неспаренных нуклеотидов нуклеазами и повторный синтез ДНК-полимеразами. Этот этап не нужен, если концы уже совместимы и имеют 3'-гидроксильные и 5'-фосфатные группы. О функции нуклеаз в NHEJ известно мало. Артемис необходим для раскручивания шпилек, формирующихся на концах ДНК во время V(D)J-рекомбинации – специфического типа NHEJ, и может также участвовать в обрезке концов при общей NHEJ. Mre11 обладает нуклеазной активностью, но, по-видимому, вовлечен в гомологичную рекомбинацию, а не в NHEJ. Полимеразы ДНК семейства X Pol λ и Pol μ (Pol4 у дрожжей) заполняют пробелы в ходе NHEJ. Дрожжи, лишенные Pol4, не способны соединять 3'-нависания, требующие заполнения пробелов, но сохраняют способность заполнять пробелы в 5'-нависаниях. Это связано с тем, что праймерный конец, используемый для инициации синтеза ДНК, менее стабилен при 3'-нависаниях, что требует специализированной полимеразы NHEJ.

Связывание

Комплекс ДНК-лигазы IV, состоящий из каталитической субъединицы ДНК-лигазы IV и ее кофактора XRCC4 (Dnl4 и Lif1 у дрожжей), осуществляет стадию лигации при репарации. XLF, также известный как Cernunnos, гомологичен дрожжевому Nej1 и также необходим для NHEJ. Хотя точная роль XLF неизвестна, он взаимодействует с комплексом XRCC4/ДНК-лигазы IV и, вероятно, участвует в стадии лигации. Недавние данные свидетельствуют о том, что XLF способствует реаденилированию ДНК-лигазы IV после лигации, восстанавливая активность лигазы и позволяя ей катализировать вторую лигацию.

Регулирование

Выбор между NHEJ и гомологической рекомбинацией для восстановления двухцепочечного разрыва регулируется на начальном этапе рекомбинации – резекцией 5'-конца. На этом этапе 5'-конец разрыва подвергается деградации нуклеазами, что приводит к образованию длинных 3'-одноцепочечных отрезков. Двухцепочечные разрывы, которые не были подвергнуты резекции, могут быть воссоединены посредством NHEJ, однако резекция даже нескольких нуклеотидов значительно ингибирует NHEJ и эффективно направляет разрыв на восстановление посредством рекомбинации.

V ((D) J рекомбинация

NHEJ играет критическую роль в V(D)J-рекомбинации – процессе, посредством которого генерируется разнообразие B- и T-клеточных рецепторов в иммунной системе позвоночных. В ходе V(D)J-рекомбинации, двунитевые разрывы с волосковыми петлями создаются нуклеазой RAG1/RAG2, которая разрезает ДНК в рекомбинационных сигнальных последовательностях. Эти волосковые петли затем раскрываются нуклеазой Артемиды и сшиваются с помощью NHEJ. Этот процесс объединяет "переменные" (V), "разнообразные" (D) и "соединяющие" (J) участки, которые, при сборке вместе, формируют вариабельный участок гена рецептора B-клеток или T-клеток. В отличие от типичного клеточного NHEJ, где наиболее благоприятным исходом является точный ремонт, подверженная ошибкам репарация в V(D)J-рекомбинации полезна тем, что она максимизирует разнообразие в кодирующей последовательности этих генов. Пациенты с мутациями в генах NHEJ не способны производить функциональные B- и T-клетки и страдают от тяжелого комбинированного иммунодефицита (SCID).

На теломерах

Теломеры обычно защищены "колпачком", который предотвращает их распознавание как двухнитевые разрывы. Потеря белков, формирующих этот колпачок, приводит к укорочению теломер и неадекватному соединению посредством NHEJ, в результате чего образуются дицентрические хромосомы, которые затем разделяются во время митоза. Парадоксально, некоторые белки NHEJ участвуют в поддержании колпачка теломер. Например, Ku локализуется в теломерах, и его делеция приводит к укорочению теломер. Ku также необходим для субтелемерного репрессии – процесса, посредством которого гены, расположенные вблизи теломер, отключаются.

Последствия дисфункции

Несколько человеческих синдромов связаны с дисфункциональным НГЭЖ. Гипоморфные мутации в генах LIG4 и XLF вызывают синдром LIG4 и SCID, вызванный дефицитом XLF, соответственно. Эти синдромы имеют много общих признаков, включая клеточную радиочувствительность, микроцефалию и тяжелый комбинированный иммунодефицит (ТКИД) из-за дефектной V(D)J-рекомбинации. Мутации, приводящие к потере функции гена Artemis, также вызывают ТКИД, но у этих пациентов не наблюдается неврологических дефектов, связанных с мутациями в генах LIG4 или XLF. Разница в степени тяжести может быть объяснена функциями мутировавших белков. Artemis является нуклеазой и, предположительно, необходима только для восстановления двухцепочечных разрывов ДНК (DSB) с поврежденными концами, в то время как ДНК-лигаза IV и XLF необходимы для всех событий НГЭЖ. Мутации в генах, участвующих в не гомологичном соединении концов, приводят к атаксии-телеангиэктазии (ген ATM), анемии Фанкони (множественные гены), а также к наследственному раку молочной железы и яичников (ген BRCA1). Многие гены НГЭЖ были инактивированы у мышей. Делеция генов XRCC4 или LIG4 вызывает эмбриональную летальность у мышей, что указывает на то, что НГЭЖ необходим для жизнеспособности млекопитающих. В отличие от этого, мыши без генов Ku или DNA PKcs жизнеспособны, вероятно, потому, что даже в отсутствие этих компонентов все еще может происходить соединение концов на низком уровне. Все мыши-мутанты по генам НГЭЖ демонстрируют фенотип ТКИД, чувствительность к ионизирующему излучению и апоптоз нейронов.

Старение

Была разработана система для измерения эффективности NHEJ у мышей. Эффективность NHEJ можно было сравнивать как между различными тканями одной и той же мыши, так и между мышами разного возраста. Эффективность была выше в фибробластах кожи, легких и почек, и ниже – в фибробластах сердца и астроцитах мозга. Более того, эффективность NHEJ снижалась с возрастом. У 5-месячных мышей снижение составило от 1,8 до 3,8 раза по сравнению с 24-месячными мышами, в зависимости от ткани. Снижение способности к NHEJ может приводить к увеличению числа невосстановленных или неправильно восстановленных разрывов двойных нитей ДНК, что, в свою очередь, может способствовать старению. (См. также теорию повреждения ДНК при старении.) Анализ уровня белка Ku80, участвующего в NHEJ, у человека, коровы и мыши показал, что уровни Ku80 значительно различаются между видами и сильно коррелируют с продолжительностью жизни этих видов.