Введение

Молекулярный механизм
Кооперативное связывание происходит в молекулярных системах связывания, содержащих более одного типа или вида молекул, и в которых один из партнеров не является моно-валентным и способен связывать более одной молекулы другого вида. В общем случае, молекулярное связывание – это взаимодействие между молекулами, приводящее к стабильному физическому объединению этих молекул. Кооперативное связывание возникает в молекулярной системе связывания, где две или более молекул лиганда могут связываться с молекулой рецептора. Связывание считается "кооперативным", если присоединение первой молекулы лиганда к рецептору изменяет сродство связывания второй молекулы лиганда. Присоединение молекул лиганда к различным участкам молекулы рецептора не является серией независимых событий. Кооперативность может быть положительной или отрицательной, то есть вероятность последующего связывания молекул лиганда с рецептором возрастает или снижается. Кооперативное связывание наблюдается во многих биополимерах, включая белки и нуклеиновые кислоты. Показано, что кооперативное связывание лежит в основе широкого спектра биохимических и физиологических процессов.

Кристиан Бор и концепция кооперативного связывания

В 1904 году Кристиан Бор изучал связывание гемоглобина с кислородом при различных условиях. При построении графика зависимости насыщения гемоглобина кислородом от парциального давления кислорода он получил сигмоидальную (или S-образную) кривую. Это указывает на то, что чем больше кислорода связано с гемоглобином, тем легче связывается дополнительный кислород, пока все центры связывания не будут насыщены. Кроме того, Бор заметил, что увеличение давления CO2 сдвигает эту кривую вправо, то есть более высокие концентрации CO2 затрудняют связывание гемоглобина с кислородом.

Уравнение Хилла

Первое описание кооперативного связывания с мультисайтовым белком было разработано А. В. Хиллом. Основываясь на наблюдениях за связыванием кислорода с гемоглобином и предположении, что кооперативность возникает из-за агрегации молекул гемоглобина, каждая из которых связывает одну молекулу кислорода, Хилл предложил феноменологическое уравнение, которое впоследствии было названо в его честь:

где – «коэффициент Хилла», обозначает концентрацию лиганда, – кажущаяся константа ассоциации (используется в исходной форме уравнения), – эмпирическая константа диссоциации, а – микроскопическая константа диссоциации (используется в современных формах уравнения и эквивалентна ). Если , система проявляет отрицательную кооперативность, в то время как кооперативность положительна, если общее число сайтов связывания лигандов является верхней границей для . Уравнение Хилла можно линеаризовать следующим образом:

«График Хилла» получают, строя зависимость от . В случае уравнения Хилла это прямая с наклоном и точкой пересечения с осью Y. Это означает, что кооперативность считается фиксированной, то есть не меняется при насыщении. Это также означает, что сайты связывания всегда проявляют одинаковую аффинность, и кооперативность не возникает из-за увеличения аффинности с ростом концентрации лиганда.

Уравнение Клотца

Работая с белками, связывающими кальций, Ирвинг Клоц разложил константы ассоциации Адейра, рассматривая ступенчатое формирование промежуточных стадий, и попытался выразить кооперативное связывание в терминах элементарных процессов, подчиняющихся закону массового действия. В его модели, – это константа ассоциации, определяющая связывание первой молекулы лиганда, – константа ассоциации, определяющая связывание второй молекулы лиганда (при условии, что первая уже связана) и так далее. Для это дает:

Важно отметить, что константы и так далее не относятся к отдельным центрам связывания. Они описывают количество занятых центров связывания, а не конкретные центры. Преимущество этой формы заключается в том, что кооперативность легко идентифицируется при анализе констант ассоциации. Если все центры связывания лигандов идентичны и характеризуются микроскопической константой ассоциации , то в отсутствие кооперативности следует ожидать (то есть ). Наличие положительной кооперативности проявляется, если превышает эти ожидаемые значения для . Уравнение Клоца (которое иногда также называют уравнением Адейра-Клоца) до сих пор часто используется в экспериментальной литературе для описания измерений связывания лигандов в терминах последовательных кажущихся констант связывания.

Уравнение Паулинга

К середине XX века возрос интерес к моделям, которые не только феноменологически описывали бы кривые связывания, но и предлагали бы лежащий в основе биохимический механизм. Линус Полинг переинтерпретировал уравнение, предложенное Адаиром, полагая, что его константы являются комбинацией константы связывания лиганда (в уравнении ниже) и энергии, возникающей в результате взаимодействия между субъединицами кооперативного белка (ниже). Полинг фактически вывел несколько уравнений, в зависимости от степени взаимодействия между субъединицами. Основываясь на неверных предположениях о локализации гемов, он выбрал неверное уравнение для описания связывания кислорода гемоглобином, предположив, что субъединицы расположены в виде квадрата. Уравнение, представленное ниже, соответствует тетраэдрической структуре, которая была бы более точной для гемоглобина:

Модель KNF

На основе результатов, показывающих, что структура кооперативных белков изменяется при связывании с лигандом, Дэниел Кошланд и его коллеги уточнили биохимическое объяснение механизма, описанного Полингом. Согласно модели KNF, кооперативность возникает в результате взаимодействий между субъединицами, сила которых меняется в зависимости от относительных конформаций вовлеченных субъединиц. Для тетраэдрической структуры (они также рассматривали линейные и квадратные структуры) они предложили следующую формулу:

где – константа ассоциации для X, – отношение состояний B и A в отсутствие лиганда («переход»), а – относительная стабильность пар соседних субъединиц по отношению к паре, в которой обе субъединицы находятся в состоянии A (следует отметить, что в статье KNF фактически представлено , число занятых сайтов, которое здесь в 4 раза больше).

Модель MWC

Модель Monod-Wyman-Changeux (MWC) для согласованных аллостерических переходов пошла дальше, исследуя кооперативность, основанную на термодинамике и трехмерных конформациях. Изначально она была сформулирована для олигомерных белков с симметрично расположенными идентичными субъединицами, каждая из которых имеет одно место связывания лиганда. Согласно этой концепции, два (или более) взаимопревращаемых конформационных состояния аллостерического белка сосуществуют в термическом равновесии. Эти состояния, часто называемые напряженным (T) и расслабленным (R), различаются по сродству к молекуле лиганда. Соотношение между двумя состояниями регулируется связыванием молекул лиганда, стабилизирующих состояние с более высоким сродством. Важно отметить, что все субъединицы молекулы изменяют состояние одновременно, что известно как "согласованный переход". Алостерическая константа изомеризации L описывает равновесие между двумя состояниями в отсутствие связанной молекулы лиганда: если L очень велико, большая часть белка находится в состоянии T в отсутствие лиганда. Если L мало (близко к единице), состояние R населено почти так же, как и состояние T. Отношение констант диссоциации лиганда из состояний T и R описывается константой c: если , оба состояния R и T имеют одинаковое сродство к лиганду, и лиганд не влияет на изомеризацию. Значение c также указывает на то, насколько изменяется равновесие между состояниями T и R при связывании лиганда: чем меньше c, тем больше равновесие смещается в сторону состояния R после одного связывания. При , фракционная занятость описывается как:

Сигмоидная кривая Хилла для аллостерических белков может быть проанализирована как прогрессивный переход от состояния T (низкое сродство) к состоянию R (высокое сродство) по мере увеличения насыщения. Угол наклона кривой Хилла также зависит от насыщения, достигая максимального значения в точке перегиба. Пересечения двух асимптот с осью y позволяют определить сродство обоих состояний к лиганду. В белках конформационные изменения часто связаны с активностью или активностью по отношению к конкретным мишеням. Именно эта активность обычно имеет физиологическое значение или измеряется экспериментально. Степень конформационного изменения описывается функцией состояния , которая обозначает долю белка, находящегося в состоянии . Как показывает энергетическая диаграмма, увеличивается по мере связывания большего количества молекул лиганда. Выражение для имеет вид:

Ключевым аспектом модели MWC является то, что кривые для и не совпадают, то есть фракционное насыщение не является прямым показателем конформационного состояния (и, следовательно, активности). Более того, степень кооперативности связывания и кооперативности активации могут сильно различаться: крайний случай демонстрируется двигателем жгутика бактерий с коэффициентом Хилла 1,7 для связывания и 10,3 для активации. Сверхлинейность отклика иногда называют ультрачувствительностью. Если аллостерический белок связывается с мишенью, которая также имеет более высокое сродство к состоянию R, то связывание с мишенью дополнительно стабилизирует состояние R, тем самым увеличивая сродство к лиганду. Если же мишень предпочтительно связывается с состоянием T, то связывание с мишенью будет оказывать негативное влияние на сродство к лиганду. Такие мишени называются аллостерическими модуляторами. С момента своего создания структура MWC была расширена и обобщена. Были предложены варианты, например, для белков с более чем двумя состояниями, белков, связывающих несколько типов лигандов или несколько типов аллостерических модуляторов.

Примеры

Список молекулярных комплексов, демонстрирующих кооперативное связывание лигандов, очень обширен, но некоторые примеры особенно примечательны своим историческим значением, необычными свойствами или физиологической важностью. Как описано в исторической части, наиболее известным примером кооперативного связывания является гемоглобин. Его четвертичная структура, установленная Максом Перуцем методом рентгеноструктурного анализа, представляет собой псевдосимметричный тетраэдр с четырьмя центрами связывания (гемами) для кислорода. Многие другие молекулярные комплексы, проявляющие кооперативное связывание, были изучены в деталях.

Мультимерические ферменты

Активность многих ферментов регулируется аллостерическими эффекторами. Некоторые из этих ферментов мультимерны и содержат несколько центров связывания регуляторов. Треониновая деаминаза была одним из первых ферментов, поведение которого предположительно напоминало гемоглобин, и было показано, что он связывает лиганды кооперативно. Впоследствии было установлено, что это тетрамерный белок. Другим ферментом, для которого изначально предполагалось кооперативное связывание лигандов, является аспартат-транс-карбамилаза. Хотя первоначальные модели соответствовали наличию четырех центров связывания, структура этого фермента была позже установлена как гексамерная Уильямом Липскомбом и его коллегами.

Ионные каналы

Большинство ионных каналов формируются из нескольких идентичных или псевдоидентичных мономеров или доменов, симметрично расположенных в биологических мембранах. Ряд классов таких каналов, чье открытие регулируется лигандами, демонстрируют кооперативное связывание этих лигандов. Еще в 1967 году (когда точная природа этих каналов оставалась неизвестной) было предположено, что никотиновые ацетилхолиновые рецепторы связывают ацетилхолин кооперативно благодаря наличию нескольких участков связывания. Выделение и характеристика рецептора показали пентамерную структуру с участками связывания, расположенными на границах между субъединицами, что подтверждается структурой домена связывания рецептора. Инозитолтрифосфатные (IP3) рецепторы представляют собой еще один класс лигандо-зависимых ионных каналов, проявляющих кооперативное связывание. Структура этих рецепторов демонстрирует четыре симметрично расположенных участка связывания IP3.

Молекулы с несколькими участками

Хотя большинство белков, демонстрирующих кооперативное связывание, представляют собой мультимерные комплексы из гомологичных субъединиц, некоторые белки содержат несколько центров связывания для одного и того же лиганда на одной полипептидной цепи. Одним из таких примеров является кальмодулин. Одна молекула кальмодулина кооперативно связывает четыре иона кальция. Её структура состоит из четырех EF-hand доменов, каждый из которых связывает один ион кальция. Молекула не имеет квадратной или тетраэдрической структуры, а образована двумя долями, каждая из которых содержит два EF-hand домена.

Факторы транскрипции

Также продемонстрировано кооперативное связывание белков с нуклеиновыми кислотами. Классическим примером является кооперативное связывание репрессора ламбда-фага с его операторами. Другие факторы транскрипции проявляют положительную кооперативность при связывании со своими мишенями, например, репрессор насосов TtgABC (n=1.6), а также условную кооперативность, демонстрируемую факторами транскрипции HOXA11 и FOXO1. В то же время, задокументированы примеры отрицательной кооперативности при связывании факторов транскрипции, как, например, для гомодимерного репрессора оперона цитохрома P450cam гидроксилазы Pseudomonas putida (n=0.56).

Конформационный рост и обязательная кооперативность

Ранее высказывалось предположение, что некоторые белки, особенно состоящие из множества субъединиц, могут регулироваться обобщенным механизмом MWC, в котором переход между R- и T-состояниями не обязательно синхронизирован по всему белку. В 1969 году Уайман предложил подобную модель со "смешанными конформациями" (то есть, некоторые протомеры находятся в R-состоянии, а некоторые – в T-состоянии) для респираторных белков у беспозвоночных. Развивая аналогичную идею, модель конформационного распространения, предложенная Дьюком и его коллегами, рассматривает модели KNF и MWC как частные случаи. В этой модели субъединица не изменяет конформацию автоматически при связывании лиганда (как в модели KNF), и не все субъединицы в комплексе меняют конформацию одновременно (как в модели MWC). Конформационные изменения носят стохастический характер, при этом вероятность перехода субъединицы в другое состояние зависит от того, связана она с лигандом или нет, а также от конформационного состояния соседних субъединиц. Таким образом, конформационные состояния могут "распространяться" по всему комплексу.

Влияние компонентов вверх и вниз по потоку на сверхчувствительность модуля

В живой клетке сверхчувствительные модули встроены в более крупную сеть с восходящими и нисходящими компонентами. Эти компоненты могут ограничивать диапазон входных сигналов, которые модуль получает, а также диапазон выходных сигналов модуля, которые сеть способна зарегистрировать. На чувствительность модульной системы влияют эти ограничения. Ограничения динамического диапазона, налагаемые нисходящими компонентами, могут приводить к эффективной чувствительности, значительно превышающей чувствительность исходного модуля, рассматриваемого отдельно.