Каналродопсины: светочувствительные ионные каналы и оптогенетика.

Введение

Класс транспортных белков

Каналродопсины — это подсемейство ретинилиденовых белков (родопсинов), функционирующих как ионные каналы, активируемые светом. Они служат сенсорными фоторецепторами в одноклеточных зеленых водорослях, контролируя фототаксис — движение в ответ на свет. При экспрессии в клетках других организмов они позволяют свету контролировать электрическую возбудимость, внутриклеточную кислотность, приток кальция и другие клеточные процессы (см. оптогенетику). Каналродопсин 1 (ChR1) и каналродопсин 2 (ChR2) из модельного организма Chlamydomonas reinhardtii являются первыми открытыми каналродопсинами. Варианты, чувствительные к различным цветам света или селективные к определенным ионам (ACR, KCR), были клонированы из других видов водорослей и протистов.

Структура

С точки зрения структуры, канальные родопсины являются ретинилиденовыми белками. Они представляют собой семь трансмембранных белков, подобных родопсину, и содержат светочувствительный изомеризируемый хромофор – все-транс-ретинал (альдегидное производное витамина А). Хромофор ретиналя ковалентно связан с остальной частью белка через протонированную основу Шиффа. В то время как большинство 7-трансмембранных белков являются G-белок-связанными рецепторами, которые открывают другие ионные каналы косвенно через вторичные мессенджеры (то есть они метаботропны), канальные родопсины непосредственно формируют ионные каналы (то есть они ионотропны). Когда комплекс все-транс-ретинала поглощает фотон, он вызывает конформационное изменение из все-транс-ретинала в 13-цис-ретинал. Это изменение индуцирует дальнейшее изменение в трансмембранном белке, открывая пору на расстояние не менее 6 Å. В течение миллисекунд ретиналь возвращается в все-транс-форму, закрывая пору и прекращая поток ионов. Структурный анализ калий-селективных канальных родопсинов (HcKCR1, HcKCR2) был проведен для понимания их ионной селективности. ACR и KCR использовались для ингибирования нейронной активности. Недавно открытые вирусные канальные родопсины (VCR1) локализуются в мембране эндоплазматического ретикулума и вызывают высвобождение кальция при освещении.

Развитие как молекулярный инструмент

В 2005 году три группы последовательно закрепили ChR2 в качестве инструмента для генетически направленного оптического дистанционного управления (оптогенетика) нейронами, нейронными цепями и поведением. Сначала лаборатория Карла Дайссерота продемонстрировала, что ChR2 может быть использован для контроля нейронов млекопитающих in vitro, достигая временной точности порядка миллисекунд (как с точки зрения задержки возбуждения, так и с точки зрения временного джиттера). Это исследование стало первым, в котором ChR2 был экспрессирован совместно с оптическим ингибитором, в данном случае – родопсином 4 позвоночных, впервые показав, что возбудимые клетки могут быть активированы и подавлены одновременно с использованием этих двух инструментов, освещая ткань на разных длинах волн. Было показано, что ChR2, при экспрессии в специфических нейронах или мышечных клетках, способен вызывать предсказуемое поведение, то есть контролировать нервную систему цельного животного, в данном случае – беспозвоночного C. elegans. Это был первый случай использования ChR2 для управления поведением животного в оптогенетическом эксперименте, позволяя генетически определенному типу клеток подвергаться оптическому дистанционному контролю. Хотя оба этих аспекта были продемонстрированы ранее в том же году группой Геро Мисенбёка, использовавшей косвенно активируемый светом ионный канал P2X2, впоследствии микробиальные опсины, такие как каналородопсин, стали доминировать в области генетически направленного дистанционного управления возбудимыми клетками благодаря своей мощности, скорости, направленности, простоте использования и временной точности прямой оптической активации, не требующей внешних химических соединений, таких как лиганды в клетке. Для преодоления основных недостатков – небольшой одноканальной проводимости (особенно в стационарном состоянии), ограничения одной оптимальной длиной волны возбуждения (~470 нм, синий), а также относительно длительного времени восстановления, не позволяющего контролируемо возбуждать нейроны с частотой выше 20–40 Гц – ChR2 был оптимизирован с помощью генной инженерии. Точечная мутация H134R (замена аминокислоты гистидин в 134-й позиции нативного белка на аргинин) привела к увеличению стационарной проводимости, как описано в статье 2005 года, в которой также было установлено, что ChR2 является оптогенетическим инструментом в C. elegans. В 2010 году группы Хегеманна и Дайссерота внедрили мутацию E123T в нативный ChR2, получив ChETA, который обладает более быстрой кинетикой включения и выключения, позволяя контролировать отдельные потенциалы действия на частотах до 200 Гц (в соответствующих типах клеток). Используя фрагменты последовательности ChR1, амплитуда фототока была впоследствии увеличена для возбуждения двух нейронных популяций на двух различных длинах волн, а также для оптогенетической индукции обучения у грызунов, экспериментального лечения болезни Паркинсона у крыс и комбинации с фМРТ (опто-фМРТ). Другие лаборатории стали пионерами в сочетании стимуляции ChR2 с кальциевой визуализацией для проведения комплексных оптических экспериментов, изучения нейронных цепей, экспрессии ChR2 из трансгенного локуса – напрямую или в условной парадигме Cre-loxP.

In 2005, three groups sequentially established ChR2 as a tool for genetically targeted optical remote control (optogenetics) of neurons, neural circuits and behavior. At first, Karl Deisseroth's lab demonstrated that ChR2 could be deployed to control mammalian neurons in vitro, achieving temporal precision on the order of milliseconds (both in terms of delay to spiking and in terms of temporal jitter). This study was the first wherein ChR2 was expressed alongside an optical silencer, vertebrate rhodopsin 4 in this case, demonstrating for the first time that excitable cells could be activated and silenced using these two tools simultaneously, illuminating the tissue at different wavelengths. It was demonstrated that ChR2, if expressed in specific neurons or muscle cells, can evoke predictable behaviors, i. e. can control the nervous system of an intact animal, in this case the invertebrate C. elegans. This was the first using ChR2 to steer the behavior of an animal in an optogenetic experiment, rendering a genetically specified cell type subject to optical remote control. Although both aspects had been illustrated earlier that year by the group of Gero Miesenböck, deploying the indirectly light gated ion channel P2X2, it was henceforth microbial opsins like channelrhodopsin that dominated the field of genetically targeted remote control of excitable cells, due to the power, speed, targetability, ease of use, and temporal precision of direct optical activation, not requiring any external chemical compound such as caged ligands. To overcome its principal downsides — the small single channel conductance (especially in steady state), the limitation to one optimal excitation wavelength (~470 nm, blue) as well as the relatively long recovery time, not permitting controlled firing of neurons above 20–40 Hz — ChR2 has been optimized using genetic engineering. A point mutation H134R (exchanging the amino acid Histidine in position 134 of the native protein for an Arginine) resulted in increased steady state conductance, as described in a 2005 paper that also established ChR2 as an optogenetic tool in C. elegans. In 2010, the groups of Hegemann and Deisseroth introduced an E123T mutation into native ChR2, yielding ChETA, which has faster on and off kinetics, permitting the control of individual action potentials at frequencies up to 200 Hz (in appropriate cell types). Using parts of the ChR1 sequence, photocurrent amplitude was later improved to allow excitation of two neuronal populations at two distinct wavelengths. the optogenetic induction of learning in rodents, the experimental treatment of Parkinson's disease in rats, and the combination with fMRI (opto fMRI). Other labs have pioneered the combination of ChR2 stimulation with calcium imaging for all optical experiments, neural circuits, ChR2 expression from a transgenic locus – directly or in the Cre lox conditional paradigm

В марте 2013 года премия Brain Prize (Grete Lundbeck European Brain Research Prize) была совместно присуждена Бамбергу, Бойдену, Дайссероту, Хегеманну, Мисенбёку и Нагелю «за их изобретение и усовершенствование оптогенетики». В том же году Хегеманн и Нагель получили премию Луи Жанте за медицину «за открытие каналородопсина». В 2015 году Бойден и Дайссерот получили премию Breakthrough Prize в области наук о жизни, а в 2020 году Мисенбёк, Хегеманн и Нагель – премию Шоу в области наук о жизни и медицины за разработку оптогенетики.

Дизайнер-канал родопсины

Канальные родопсины являются ключевыми инструментами в оптогенетике. C-концевой участок Channelrhodopsin 2 простирается во внутриклеточное пространство и может быть заменен флуоресцентными белками, не влияя на функцию канала. Такая конструкция-химера может быть полезна для визуализации морфологии клеток, экспрессирующих ChR2, то есть для одновременного определения клеток, меченных флуоресцентным белком, и контроля активности посредством канального родопсина. Показано, что точечные мутации вблизи ретинального связывающего кармана влияют на биофизические свойства канального родопсина, что приводит к созданию разнообразных инструментов.

Кинетическая

Закрытие канала после оптической активации может быть существенно замедлено мутацией аминокислотных остатков C128 или D156. Эта модификация приводит к появлению сверхчувствительных каналородопсинов, которые могут открываться синим световым импульсом и закрываться зеленым или желтым световым импульсом (опсины с функцией переключения). Мутация остатка E123 ускоряет кинетику канала (ChETA), и полученные мутанты ChR2 использовались для возбуждения нейронов с частотой до 200 Гц. В целом, каналородопсины с медленной кинетикой обладают большей светочувствительностью на популяционном уровне, поскольку открытые каналы накапливаются со временем даже при низкой интенсивности света.

Амплитуда фототока

Мутанты H134R и T159C демонстрируют увеличенные фототоки, а комбинация T159 и E123 (ET/TC) имеет несколько большие фототоки и незначительно более быструю кинетику, чем дикий тип ChR2. ChIEF, химера и точечный мутант ChR1 и ChR2, демонстрирует большие фототоки, незначительную десенсибилизацию и кинетику, схожую с кинетикой дикого типа ChR2. Варианты с увеличенным временем открытия (ChR2 XXL) производят чрезвычайно большие фототоки и обладают высокой светочувствительностью на популяционном уровне.

Длина волны

Химерные канальные родопсины были созданы путем объединения трансмембранных спиралей ChR1 и VChR1, что привело к разработке канальных родопсинов с красным сдвигом спектра (таких как C1V1 и ReaChR). ReaChR обладает улучшенным транспортом к мембране и высокой экспрессией в клетках млекопитающих и был использован для малоинвазивной транскраниальной активации мотонейронов ствола мозга. Поиск гомологичных последовательностей в других организмах позволил получить канальные родопсины с улучшенными спектральными характеристиками и более выраженным красным сдвигом (Chrimson). В сочетании с ChR2 эти желтые/красные светочувствительные канальные родопсины позволяют независимо контролировать две популяции нейронов световыми импульсами разного цвета. Канальный родопсин со сдвигом в синюю область спектра был обнаружен в водоросли Scherffelia dubia. После внесения некоторых изменений для улучшения транспорта к мембране и скорости, полученный инструмент (CheRiff) генерировал большие фототоки при возбуждении на длине волны 460 нм. Он был объединен с генетически кодируемым индикатором кальция jRCaMP1b в полностью оптическую систему под названием OptoCaMP.

Ионная селективность

Большинство канальных родопсинов являются неспецифическими катионными каналами. При экспрессии в нейронах они проводят преимущественно ионы Na+ и, следовательно, деполяризуют (возбуждают) клетку. Созданы варианты с умеренной или высокой проницаемостью для кальция (CatCh, CapChRs). Недавно у различных протистов были обнаружены K+-специфичные канальные родопсины (KCR, WiChR). При экспрессии в нейронах калий-селективные каналородопсины гиперполяризуют мембрану при освещении, предотвращая генерацию потенциалов действия (ингибирующие). Мутация E90 в положительно заряженную аминокислоту аргинин превращает канальный родопсин из неспецифического катионного канала в хлоридный канал (ChloC). Селективность к Cl- была дополнительно повышена путем замены отрицательно заряженных остатков в поре канала, что сделало потенциал обращения более отрицательным. Анионпроводящие канальные родопсины (iChloC, iC++, GtACR) ингибируют генерацию потенциалов действия нейронов в клеточных культурах и у целых животных при освещении синим светом. Кальций-селективные канальные родопсины были разработаны для активации кальций-зависимых ферментов в клетках.

Приложения

Каналородопсины могут быть легко экспрессированы в возбудимых клетках, таких как нейроны, с использованием различных методов трансфекции (вирусная трансфекция, электропорация, генная пушка) или трансгенных животных. Светопоглощающий пигмент ретиналь присутствует в большинстве клеток (позвоночных) в виде витамина А, что позволяет фотостимулировать нейроны без добавления каких-либо химических соединений. До открытия каналородопсинов нейробиологи ограничивались записью активности нейронов в мозге и установлением корреляции между этой активностью и поведением. Этого недостаточно для доказательства того, что зарегистрированная нейронная активность действительно вызвала данное поведение. Контроль над сетями генетически модифицированных клеток с помощью света, новая область, известная как оптогенетика, позволяет исследователям изучать причинно-следственную связь между активностью в определенной группе нейронов и психическими процессами, например, принятием решений. Оптический контроль поведения был продемонстрирован на нематодах, плодовой мушке, данио-рерио и мышах. Недавно были сконструированы хлорид-проводящие каналородопсины, которые также были обнаружены в природе. Еще одна интересная пара – хлоридный канал, чувствительный к синему свету, GtACR2, и катионный канал, чувствительный к красному свету, Chrimson, которые были объединены в единый белок (BiPOLES) для двунаправленного контроля мембранного потенциала. С помощью флуоресцентно меченого ChR2 можно идентифицировать аксоны и синапсы, стимулируемые светом. Трансфицированные культивируемые нейронные сети могут быть стимулированы для выполнения определенных желаемых действий, что находит применение в робототехнике и системах управления. ChR2 также использовался для картирования связей между отдаленными областями мозга и для определения пространственного расположения входов на дендритном дереве отдельных нейронов. В 2006 году было сообщено, что трансфекция каналородопсином может восстановить зрение слепым мышам. Нейроны могут переносить экспрессию ChR в течение длительного времени, и несколько лабораторий тестируют оптогенетическую стимуляцию для решения медицинских задач. У слепых мышей зрительная функция может быть частично восстановлена путем экспрессии ChR2 в клетках внутренней сетчатки. В 2021 году красный светочувствительный ChR ChrimsonR был доставлен вирусным вектором в глаза человека, страдающего дегенерацией сетчатки (пигментным ретинитом), что привело к частичному восстановлению его зрения. Оптические кохлеарные имплантаты показали хорошие результаты в экспериментах на животных и в настоящее время проходят клинические испытания. В будущем ChR могут найти еще больше медицинских применений, например, для глубокой стимуляции мозга у пациентов с болезнью Паркинсона или для контроля определенных форм эпилепсии.

Channelrhodopsins can be readily expressed in excitable cells such as neurons using a variety of transfection techniques (viral transfection, electroporation, gene gun) or transgenic animals. The light absorbing pigment retinal is present in most cells (of vertebrates) as Vitamin A, making it possible to photostimulate neurons without adding any chemical compounds. Before the discovery of channelrhodopsins, neuroscientists were limited to recording the activity of neurons in the brain and correlate this activity with behavior. This is not sufficient to prove that the recorded neural activity actually caused that behavior. Controlling networks of genetically modified cells with light, an emerging field known as Optogenetics., allows researchers now to explore the causal link between activity in a specific group of neurons and mental events, e. g. decision making. Optical control of behavior has been demonstrated in nematodes, fruit flies, zebrafish, and mice. Recently, chloride conducting channelrhodopsins have been engineered and were also found in nature. Another interesting pair is the blue light sensitive chloride channel GtACR2 and the red light sensitive cation channel Chrimson which have been combined in a single protein (BiPOLES) for bidirectional control of membrane potential. Using fluorescently labeled ChR2, light stimulated axons and synapses can be identified. Transfected cultured neuronal networks can be stimulated to perform some desired behaviors for applications in robotics and control. ChR2 has also been used to map long range connections from one side of the brain to the other, and to map the spatial location of inputs on the dendritic tree of individual neurons. In 2006, it was reported that transfection with Channelrhodopsin could restore eyesight to blind mice. Neurons can tolerate ChR expression for a long time, and several laboratories are testing optogenetic stimulation to solve medical needs. In blind mice, visual function can be partially restored by expressing ChR2 in inner retinal cells. In 2021, the red light sensitive ChR ChrimsonR was virally delivered to the eyes of a human patient suffering from retinal degeneration (retinitis pigmentosa), leading to partial recovery of his vision. Optical cochlear implants have been shown to work well in animal experiments and are currently undergoing clinical trials. In the future, ChRs may find even more medical applications, e. g. for deep brain stimulation of Parkinson patients or to control certain forms of epilepsy.