Жарыққа сезімтал иондық каналдар: Channelrhodopsin тобының сипаттамасы

Кіріспе

Транспорттық ақуыздар класы

Каналродопсиндер – жарықпен ашылатын иондық каналдар ретінде жұмыс істейтін ретинилиден ақуыздарының (родопсиндер) кіші тобы. Олар бір жасушалы жасыл балдырларда фототаксисті – жарыққа жауап ретінде қозғалысты бақылайтын сенсорлық фоторецепторлар қызметін атқарады. Басқа организмдердің жасушаларында экспрессияланғанда, олар жарықтың электрлік қозуын, жасушаішілік қышқылдықты, кальций ағынын және басқа да жасушалық процестерді басқаруға мүмкіндік береді (оптогенетикаға қараңыз). Chlamydomonas reinhardtii модельдік организмінен алынған Channelrhodopsin 1 (ChR1) және Channelrhodopsin 2 (ChR2) – алғаш рет ашылған каналродопсиндер. Түрлі жарық түстеріне сезімтал немесе нақты иондарға таңдамалы (ACR, KCR) болатын варианттар басқа балдырлар мен протостар түрлерінен клондалған.

Құрылымы

Құрылымы жағынан каналды родопсиндер ретинилиденді ақуыздар болып табылады. Олар родопсин сияқты жеті трансмембраналық ақуыздар және жарық әсерінен изомерленетін барлық транс-ретиналь (А витаминінің альдегид туындысы) хромофорын қамтиды. Ретиналь хромофоры протонды Шифф базасы арқылы ақуыздың қалған бөлігімен ковалентті байланысқа түседі. Көптеген 7 трансмембраналық ақуыздар екінші хабаршылар арқылы басқа иондық каналдарды жанама түрде ашатын G белоктарымен байланысқан рецепторлар (яғни, метаботроптық) болса, каналды родопсиндер тікелей иондық каналдарды құрайды (яғни, ионтроптық). Барлық транс-ретиналь кешені фотонды сіңірген кезде, ол барлық транс түрінен 13-цис түріне конформациялық өзгеріске ұшырайды. Бұл өзгеріс трансмембраналық ақуызда тағы бір өзгеріске әкеледі, нәтижесінде кем дегенде 6 Å тесік ашылады. Миллисекундтар ішінде ретиналь бастапқы транс түріне қайта оралып, тесікті жабады және иондардың ағынын тоқтатады. Калийге селективті каналды родопсиндер (HcKCR1, HcKCR2) олардың иондық таңдамасын түсіну үшін құрылымдық жағынан зерттелді. ACR және KCR нейрондық белсенділікті тежеу үшін қолданылған. Жақында ашылған вирустық каналды родопсиндер (VCR1) эндоплазмалық тордың мембранасына орналасқан және жарыққа ұшырағанда кальцийдің босатылуына себеп болады.

Молекулалық құрал ретінде даму

2005 жылы үш топ ChR2 генін генетикалық түрде бағытталған оптикалық қашықтан басқару (оптогенетика) құралы ретінде ретті түрде пайдаланды, осы арқылы нейрондарды, нейрондық тізбектерді және мінез-құлықты басқарды. Алғашқыда Карл Дайссероттың зертханасы ChR2-нің сүтқоректілердің нейрондарын *in vitro* жағдайында басқаруға қолданылатынын көрсетті, бұл миллисекундтармен өлшенетін уақыттық дәлдікке қол жеткізуге мүмкіндік берді (импульске кешігу және уақыттық тербеліс тұрғысынан). Бұл зерттеу ChR2-нің оптикалық белсенділігін жоятын құралмен (бұл жағдайда омыртқалы жануарлардың родопсині 4) бірге экспрессияланған алғашқы жұмыс болды, бұл қоздырылатын жасушаларды бір мезгілде осы екі құралды қолдана отырып, әртүрлі толқын ұзындығында жарықтандыру арқылы белсендіруге және тоқтатуға болатынын көрсетті. Егер ChR2 белгілі бір нейрондарда немесе бұлшықет жасушаларында экспрессияланса, ол болжамды мінез-құлықты тудыра алады, яғни тұтас жануардың жүйке жүйесін басқара алады (бұл жағдайда омыртқасыз C. elegans). Бұл оптогенетикалық экспериментте жануардың мінез-құлығын басқару үшін ChR2-ні қолданған алғашқы тәжірибе болды, генетикалық тұрғыдан анықталған жасуша типін оптикалық қашықтан басқаруға бейімдеді. Алдында Геро Мисенбок тобы P2X2 иондық каналын тікелей емес жарықпен ашу арқылы осы екі аспектіні көрсеткенімен, кейіннен генетикалық түрде бағытталған қоздырылатын жасушаларды қашықтан басқару саласында каналродопсин сияқты микробтық опсиндер басымдыққа ие болды. Бұл опсиндердің қуаты, жылдамдығы, бағытталуы, пайдаланудың қарапайымдығы және тікелей оптикалық белсендірудің уақыттық дәлдігімен байланысты, бұл бұғаздалған лигандтар сияқты сыртқы химиялық қосылыстарды қажет етпейді. ChR2-нің негізгі кемшіліктерін – кішкентай бір каналдық өткізгіштігін (әсіресе тұрақты күйде), бірнеше оптималдық қоздыру толқын ұзындығына (шамамен 470 нм, көк түс) шектелуін және салыстырмалы түрде ұзақ қалпына келтіру уақытын (20-40 Гц жоғары жиілікте нейрондардың бақыланатын оқшаулануына жол бермейтін) – жеңу үшін ChR2 генетикалық инженерия арқылы оңтайландырылды. H134R нүктелік мутациясы (туған ақуыздың 134-орындағы гистидин аминоқышқылын аргининге алмастыру) 2005 жылғы мақалада сипатталғандай, тұрақты күйдегі өткізгіштіктің артуына әкелді, сонымен қатар ChR2-нің C. elegans-та оптогенетикалық құрал ретінде пайдалы екенін көрсетті. 2010 жылы Хегеманн мен Дайссерот топтары E123T мутациясын ChR2-ге енгізіп, ChETA-ны жасады, ол тез қосылу және ажыралу кинетикасына ие, бұл тиісті жасуша түрлерінде 200 Гц-ке дейін жиілікте жеке әрекет потенциалдарын басқаруға мүмкіндік берді. ChR1 тізбегінің бөліктерін пайдаланып, фототок амплитудасы кейіннен жақсартылды, бұл екі түрлі толқын ұзындығында екі нейрондық популяцияны қозуға мүмкіндік берді. Сонымен қатар, кеміргіштерде оқудың оптогенетикалық индукциясы, егеуқырларда Паркинсон ауруын емдеу және fMRI (опто-fMRI) комбинациясы жүзеге асырылды. Басқа зертханалар ChR2 стимуляциясын кальций бейнелеумен біріктіріп, барлық оптикалық эксперименттер, нейрондық тізбектер және трансгендік локустан ChR2 экспрессиясын (тікелей немесе Cre-lox шартты парадигмасында) жүзеге асырды. 2013 жылдың наурыз айында Бамберг, Бойден, Дайссерот, Хегеманн, Мисенбок және Нагель "оптогенетиканы ойлап табуы және жетілдіруі" үшін Грете Лундбек Еуропалық ми зерттеулері сыйлығын (Brain Prize) бірлесіп алды. Сол жылы Хегеманн мен Нагель "каналродопсиннің ашылуы" үшін медицина саласындағы Луи Жанте сыйлығын алды. 2015 жылы Бойден мен Дайссерот өмір ғылымдарының ілгерілеу сыйлығын (Breakthrough Prize in Life Sciences) алды, ал 2020 жылы Мисенбок, Хегеманн және Нагель оптогенетиканы дамыту үшін өмір ғылымдары мен медицина саласындағы Шоу сыйлығын (Shaw Prize in Life Science and Medicine) алды.

In 2005, three groups sequentially established ChR2 as a tool for genetically targeted optical remote control (optogenetics) of neurons, neural circuits and behavior. At first, Karl Deisseroth's lab demonstrated that ChR2 could be deployed to control mammalian neurons in vitro, achieving temporal precision on the order of milliseconds (both in terms of delay to spiking and in terms of temporal jitter). This study was the first wherein ChR2 was expressed alongside an optical silencer, vertebrate rhodopsin 4 in this case, demonstrating for the first time that excitable cells could be activated and silenced using these two tools simultaneously, illuminating the tissue at different wavelengths. It was demonstrated that ChR2, if expressed in specific neurons or muscle cells, can evoke predictable behaviors, i. e. can control the nervous system of an intact animal, in this case the invertebrate C. elegans. This was the first using ChR2 to steer the behavior of an animal in an optogenetic experiment, rendering a genetically specified cell type subject to optical remote control. Although both aspects had been illustrated earlier that year by the group of Gero Miesenböck, deploying the indirectly light gated ion channel P2X2, it was henceforth microbial opsins like channelrhodopsin that dominated the field of genetically targeted remote control of excitable cells, due to the power, speed, targetability, ease of use, and temporal precision of direct optical activation, not requiring any external chemical compound such as caged ligands. To overcome its principal downsides — the small single channel conductance (especially in steady state), the limitation to one optimal excitation wavelength (~470 nm, blue) as well as the relatively long recovery time, not permitting controlled firing of neurons above 20–40 Hz — ChR2 has been optimized using genetic engineering. A point mutation H134R (exchanging the amino acid Histidine in position 134 of the native protein for an Arginine) resulted in increased steady state conductance, as described in a 2005 paper that also established ChR2 as an optogenetic tool in C. elegans. In 2010, the groups of Hegemann and Deisseroth introduced an E123T mutation into native ChR2, yielding ChETA, which has faster on and off kinetics, permitting the control of individual action potentials at frequencies up to 200 Hz (in appropriate cell types). Using parts of the ChR1 sequence, photocurrent amplitude was later improved to allow excitation of two neuronal populations at two distinct wavelengths. the optogenetic induction of learning in rodents, the experimental treatment of Parkinson's disease in rats, and the combination with fMRI (opto fMRI). Other labs have pioneered the combination of ChR2 stimulation with calcium imaging for all optical experiments, neural circuits, ChR2 expression from a transgenic locus – directly or in the Cre lox conditional paradigm

In March 2013, the Brain Prize (Grete Lundbeck European Brain Research Prize) was jointly awarded to Bamberg, Boyden, Deisseroth, Hegemann, Miesenböck, and Nagel for "their invention and refinement of optogenetics". The same year, Hegemann and Nagel received the Louis Jeantet Prize for Medicine for "the discovery of channelrhodopsin". In 2015, Boyden and Deisseroth received the Breakthrough Prize in Life Sciences and in 2020, Miesenböck, Hegemann and Nagel received the Shaw prize in Life Science and Medicine for the development of optogenetics.

Дизайнерлік-арналы родопсиндер

Каналдық родопсиндар оптогенетикада маңызды құралдар болып табылады. Channelrhodopsin 2-нің C терминалы жасуша ішіндегі кеңістікке дейін созылады және каналдың жұмысына әсер етпей флуоресцентті ақуыздармен алмастырылуы мүмкін. Мұндай біріктірілген құрылым ChR2 экспрессиялайтын жасушалардың морфологиясын көруге, яғни бір уақытта қай жасушалардың FP таңбасымен белгіленгенін анықтауға және каналдық родопсин арқылы олардың белсенділігін басқаруға көмектеседі. Торлық байланыс қуысына жақын нүктелік мутациялар каналдық родопсиннің биофизикалық қасиеттерін өзгертетіні көрсетілді, соның нәтижесінде әртүрлі құралдар пайда болды.

Кинетика

Оптикалық белсендірілгеннен кейін каналдың жабылуы C128 немесе D156 белок қалдықтарын мутациялау арқылы айтарлықтай кешіктірілуі мүмкін. Бұл өзгеріс көк жарық импульсімен ашылып, жасыл немесе сары жарық импульсімен жабылатын аса сезімтал каналродопсиндерді (Step функциясы опсиндерін) құрайды. E123 қалдығын мутациялау канал кинетикасын (ChETA) үдетіп, нәтижеде алынған ChR2 мутанттары 200 Гц дейін нейрондарды қоздыру үшін қолданылды. Жалпы, баяу кинетикаға ие каналродопсиндер популяциялық деңгейде жарыққа сезімталдығы жоғары, себебі ашық каналдар тіпті төмен жарық деңгейінде де уақыт өте келе жинақталады.

Фотоағымның амплитудасы

H134R және T159C мутанттары күшейтілген фототоктарды көрсетеді, ал T159 және E123 (ET/TC) комбинациясы табиғи типтегі ChR2-ге қарағанда сәл үлкен фототоктар мен сәл жылдам кинетикаға ие. ChIEF, ChR1 және ChR2 химерасы және нүктелік мутанты, үлкен фототоктар, аздаған десенсибилизация және табиғи типтегі ChR2-ге ұқсас кинетиканы көрсетеді. Ұзақ ашық уақытқа ие (ChR2 XXL) варианттары өте үлкен фототоктарды тудырады және популяциялық деңгейде өте жарыққа сезімтал.

Толқын ұзындығы

Химерлік канал родопсиндері ChR1 және VChR1 трансмембраналық спиральдарын біріктіру арқылы жасалды, нәтижесінде қызыл спектрлік қалыптасуы бар ChR-лер пайда болды (мысалы, C1V1 және ReaChR). ReaChR сүтқоректі жасушаларында мембраналық тасымалдауды және күшті экспрессияны жақсартты, сондай-ақ ми сабасының қозғалтқыш нейрондарының аз инвазивті, транскраниалды жандандырылуы үшін қолданылды. Басқа организмдердегі гомологты тізбектерді іздеу арқылы спектрлік жағынан жақсартылған және күшті қызыл қалыптасқан канал родопсиндері (Chrimson) табылды. ChR2-мен бірге қолданылғанда, бұл сары/қызыл жарыққа сезімтал канал родопсиндері әртүрлі түсті жарық импульстарымен екі нейрон популяциясын тәуелсіз басқаруға мүмкіндік береді. Scherffelia dubia балдырмасында көк спектрлік қалыптасуы бар канал родопсині анықталды. Мембраналық тасымалдауды және жылдамдықты жақсартуға бағытталған инженерлік жұмыстардан кейін алынған құрал (CheRiff) 460 нм толқындағы қозу кезінде үлкен фототоктарды өндірді. Ол генетикалық түрде кодталған кальций индикаторы jRCaMP1b-мен бірге OptoCaMP деп аталатын толық оптикалық жүйеде қолданылды.

Иондық селективтілік

Көптеген каналды родопсиндер спецификалық емес катиондық арналар болып табылады. Нейрондарда экспрессияланғанда, олар көбінесе Na+ иондарын өткізеді, сондықтан деполяризациялайды (қоздырғыш). Кальцийдің орташа немесе жоғары өткізгіштігіне ие варианттар (CatCh, CapChRs) жасалған. Жақында K+ спецификалық каналды родопсиндер (KCR, WiChR) әртүрлі протостарда табылды. Нейрондарда экспрессияланған кезде калийге селективті каналды родопсиндер жарықтандыру кезінде мембрананы гиперполяризациялап, импульстардың пайда болуын болдырмайды (тежегіш). E90 аминоқышқылының оң зарядталған аргининге мутациялануы каналды родопсинді спецификалық емес катиондық арнадан хлорид өткізетін арнаға (ChloC) айналдырады. Арнаның ішіндегі теріс зарядталған қалдықтарды алмастыру арқылы хлоридке деген селективтілік одан әрі жақсартылды, бұл кері потенциалды теріс жасайды. Анион өткізетін каналды родопсиндер (iChloC, iC++, GtACR) көк жарықпен жарықтандырылғанда жасуша мәдениетінде де, тұтас жануарларда да нейрондық импульстарды тежейді. Кальцийге селективті каналды родопсиндер жасушалардағы кальцийге тәуелді ферменттерді белсендіру үшін жасалған.

Қолданбалар

Каналродопсиндер әр түрлі трансфекция әдістері (вирустық трансфекция, электропорация, гендік қару) немесе трансгендік жануарларды пайдалану арқылы нейрондар сияқты қозуға қабілетті жасушаларда оңай экспрессияланады. Жарық сіңіретін пигмент ретиналь (торша) көптеген (омыртқалылардың) жасушаларында А витамині түрінде кездеседі, бұл химиялық қосылыстарды қоспай нейрондарды фотостимуляциялауға мүмкіндік береді. Каналродопсиндер ашылғанға дейін нейробиологтар мидағы нейрондардың белсенділігін жазумен және осы белсенділікті мінез-құлықпен байланыстырумен шектелген. Бұл, аталған мінез-құлықты тудырғанын дәлелдеу үшін жеткіліксіз. Генетикалық түрлендірілген жасушалардың желісін жарықпен басқару, оптогенетика деп аталатын дамып келе жатқан сала, зерттеушілерге белгілі бір нейрондар тобының белсенділігі мен саналық құбылыстар арасындағы себеп-салдарлық байланысты зерттеуге мүмкіндік береді, мысалы, шешім қабылдау. Мінез-құлықты оптикалық түрде басқару нематодтарда, жеміс шыбындарыда, зебра балықтарында және егешқұйрықтарда көрсетілген. Жақында хлорид иондарын өткізгіш каналродопсиндер жасалды және олар табиғатта да табылды. Тағы бір қызықты жұп – көк жарыққа сезімтал хлоридтік канал GtACR2 және қызыл жарыққа сезімтал катиондық канал Chrimson, олар мембраналық потенциалды екі бағытта басқару үшін бір белокқа (BiPOLES) біріктірілген. Флуоресценттік таңбаланған ChR2 арқылы жарықпен стимуляцияланған аксондар мен синапстарды анықтауға болады. Трансфекцияланған нейрондық желілерді робототехника және басқару салаларында қолдану үшін қажетті әрекеттерді орындауға итермелеуге болады. ChR2 сонымен қатар мидың бір жағынан екінші жағына дейінгі ұзақ қашықтықтағы байланыстарды картаға түсіруге және жеке нейрондардың дендриттік ағашындағы кіріс ақпаратының кеңістіктік орналасуын картаға түсіруге пайдаланылды. 2006 жылы каналродопсинмен трансфекциялау соқыр егешқұйрықтардың көру қабілетін қалпына келтіретіні хабарланды. Нейрондар ChR экспрессиясын ұзақ уақыт бойы көтере алады, және бірнеше зертханалар медициналық қажеттіліктерді шешу үшін оптогенетикалық стимуляцияны сынап жатыр. Соқыр егешқұйрықтарда көру функциясы ChR2 ішкі торлы қабықтың жасушаларында экспрессиялану арқылы ішінара қалпына келтірілуі мүмкін. 2021 жылы қызыл жарыққа сезімтал ChR ChrimsonR вирустық жолмен торсық қабығының дегенерациясынан (пигменттік ретинит) зардап шеккен адамның көзіне енгізілді, бұл оның көру қабілетін ішінара қалпына келтірді. Оптикалық кохлеарлық имплантаттар жануарлармен жүргізілген тәжірибелерде жақсы жұмыс істейтіні көрсетілді және қазіргі уақытта клиникалық сынақтардан өтуде. Болашақта ChR-лер медициналық мақсаттарда, мысалы, Паркинсон ауруымен ауыратын науқастардың миын терең стимуляциялау немесе эпилепсияның кейбір түрлерін бақылау үшін қолданылуы мүмкін.

Channelrhodopsins can be readily expressed in excitable cells such as neurons using a variety of transfection techniques (viral transfection, electroporation, gene gun) or transgenic animals. The light absorbing pigment retinal is present in most cells (of vertebrates) as Vitamin A, making it possible to photostimulate neurons without adding any chemical compounds. Before the discovery of channelrhodopsins, neuroscientists were limited to recording the activity of neurons in the brain and correlate this activity with behavior. This is not sufficient to prove that the recorded neural activity actually caused that behavior. Controlling networks of genetically modified cells with light, an emerging field known as Optogenetics., allows researchers now to explore the causal link between activity in a specific group of neurons and mental events, e. g. decision making. Optical control of behavior has been demonstrated in nematodes, fruit flies, zebrafish, and mice. Recently, chloride conducting channelrhodopsins have been engineered and were also found in nature. Another interesting pair is the blue light sensitive chloride channel GtACR2 and the red light sensitive cation channel Chrimson which have been combined in a single protein (BiPOLES) for bidirectional control of membrane potential. Using fluorescently labeled ChR2, light stimulated axons and synapses can be identified. Transfected cultured neuronal networks can be stimulated to perform some desired behaviors for applications in robotics and control. ChR2 has also been used to map long range connections from one side of the brain to the other, and to map the spatial location of inputs on the dendritic tree of individual neurons. In 2006, it was reported that transfection with Channelrhodopsin could restore eyesight to blind mice. Neurons can tolerate ChR expression for a long time, and several laboratories are testing optogenetic stimulation to solve medical needs. In blind mice, visual function can be partially restored by expressing ChR2 in inner retinal cells. In 2021, the red light sensitive ChR ChrimsonR was virally delivered to the eyes of a human patient suffering from retinal degeneration (retinitis pigmentosa), leading to partial recovery of his vision. Optical cochlear implants have been shown to work well in animal experiments and are currently undergoing clinical trials. In the future, ChRs may find even more medical applications, e. g. for deep brain stimulation of Parkinson patients or to control certain forms of epilepsy.