Введение
Механизм восстановления ДНК
Ремонт нуклеотидной экзиции – это механизм восстановления ДНК. Повреждение ДНК происходит постоянно под воздействием химических веществ (например, интеркалирующих агентов), радиации и других мутагенов. Существуют три пути иссечения для восстановления повреждений одноцепочечной ДНК: ремонт нуклеотидной экзиции (NER), иссечение оснований (BER) и исправление ошибок при репликации ДНК (MMR). В то время как путь BER может распознавать специфические, не объемные повреждения в ДНК, он способен корректировать только поврежденные основания, которые удаляются специфическими гликозилазами. Аналогично, путь MMR нацелен исключительно на неправильно спаренные пары оснований Уотсона-Крика. Ремонт нуклеотидной экзиции (NER) является особенно важным механизмом, удаляющим повреждения ДНК, вызванные ультрафиолетовым излучением (УФ). УФ-повреждение ДНК приводит к образованию объемных аддуктов ДНК – эти аддукты в основном представлены тиминовыми димерами и 6,4-фотопродуктами. Распознавание повреждения приводит к удалению короткого одноцепочечного сегмента ДНК, содержащего поражение. Неповрежденная одноцепочечная ДНК остается и используется ДНК-полимеразой в качестве матрицы для синтеза короткой комплементарной последовательности. Завершающая лигация для завершения NER и формирования двухцепочечной ДНК осуществляется ДНК-лигазой. NER можно разделить на два подпути: глобальный геномный NER (GG NER или GGR) и NER, связанный с транскрипцией (TC NER или TCR). Эти два подпути различаются способом распознавания повреждений ДНК, но используют один и тот же процесс для вскрытия, восстановления и лигации поражения. Важность NER подтверждается тяжелыми заболеваниями человека, возникающими в результате врожденных генетических мутаций белков NER. Ксеродерма пигментная и синдром Кокейна – два примера заболеваний, связанных с NER.
У эукариот
Ремонт отсечения нуклеотидов более сложен у эукариотов, чем у прокариотов, но общий принцип схож. В клетках млекопитающих в NER участвуют 9 основных белков. Дефицит определенных белков приводит к заболеваниям, названия которых связаны с этими белками. XPA, XPB, XPC, XPD, XPE, XPF и XPG связаны с пигментной ксеродермой, а CSA и CSB – с синдромом Кокейна. Кроме того, белки ERCC1, RPA, RAD23A, RAD23B и другие также участвуют в нуклеотидном ремонте отсечением. Более полный список белков, участвующих в NER, приведен ниже. Эукариотический ремонт отсечения нуклеотидов можно разделить на два подпути: глобальный геномный NER (GG NER) и NER, связанный с транскрипцией (TC NER). Для каждого подпути в распознавании повреждений ДНК участвуют три различных набора белков. После распознавания повреждений все три подпути сходятся на этапах двойного разреза, восстановления и лигирования.
Глобальный геномный NER (GG-NER)
Глобальный геномный NER восстанавливает повреждения в обеих нитях ДНК – транскрибируемых и нетранскрибируемых – в активных и неактивных генах по всему геному. Этот процесс не зависит от транскрипции. В этом пути участвуют несколько белков, "определяющих повреждения", включая комплексы, связывающие повреждения ДНК (DDB) и XPC-Rad23B, которые постоянно сканируют геном и распознают искажения структуры двойной спирали: комплекс XPC-Rad23B отвечает за распознавание искажений, а DDB1 и DDB2 (XPE) также могут распознавать некоторые типы повреждений, вызванных ультрафиолетовым излучением. Кроме того, XPA выполняет функцию в распознавании повреждений, которая пока недостаточно изучена. После обнаружения поврежденного участка к поврежденной ДНК рекрутируются последующие белки, осуществляющие репарацию, для подтверждения наличия повреждения ДНК, удаления поврежденного участка ДНК, окружающего дефект, и последующего заполнения образовавшегося пробела.
Ремонт с соединением транскрипции (TC-NER)
Процесс восстановления нуклеотидов при вырезании контролируется у *Escherichia coli* эндонуклеазным ферментным комплексом UvrABC, который состоит из четырех белков Uvr: UvrA, UvrB, UvrC и ДНК-геликаза II (иногда также известной как UvrD в этом комплексе). Сначала комплекс UvrA-UvrB сканирует ДНК, при этом субъединица UvrA распознает искажения в спирали, вызванные, например, пиримидиновыми димерами. Когда комплекс обнаруживает такое искажение, субъединица UvrA покидает комплекс, а белок UvrC присоединяется и связывается с мономером UvrB, образуя новый димер UvrBC. UvrB разрезает фосфодиэстерную связь на 4 нуклеотида ниже по течению повреждения ДНК, а UvrC разрезает фосфодиэстерную связь на 8 нуклеотидов выше по течению повреждения ДНК, создавая вырезанный сегмент из 12 нуклеотидов. Затем ДНК-геликаза II (иногда называемая UvrD) удаляет вырезанный сегмент, активно разрывая водородные связи между комплементарными основаниями. Образовавшийся пробел затем заполняется с помощью ДНК-полимеразы I и ДНК-лигазы. Основной процесс вырезания очень похож в высших клетках, но в этих клетках обычно задействовано гораздо больше белков. *E. coli* является простым примером. TC NER также существует у бактерий и опосредован белком TRCF (Mfd). TRCF является SF2-АТФазой, которая использует гидролиз АТФ для транслокации по двухцепочечной ДНК вверх по течению от пузыря транскрипции и перемещения РНК-полимеразы вперед, тем самым инициируя диссоциацию тройного комплекса элонгации РНК-полимеразы. TRCF также рекрутирует механизм нуклеотидного вырезания Uvr(A)BC посредством прямого физического взаимодействия с субъединицей UvrA.
Рак
Хотя исторические исследования демонстрируют непостоянные результаты, генетические вариации или мутации в генах нуклеотидного иссечения могут влиять на риск развития рака, изменяя эффективность репарации. Однонуклеотидные полиморфизмы (СНП) и несинонимичные кодирующие СНП (nsSNP) встречаются в очень низких концентрациях (>1%) в популяции человека. Если такие мутации локализованы в генах NER или регуляторных последовательностях, они могут негативно сказываться на способности ДНК к восстановлению, что повышает вероятность развития рака. Несмотря на то, что функциональное влияние всех полиморфизмов не изучено, некоторые полиморфизмы в генах репарации ДНК или их регуляторных последовательностях индуцируют фенотипические изменения и вовлечены в канцерогенез. Исследование случаев рака легких выявило умеренную связь между СНП, специфичными для NER, и риском рака легких. Полученные результаты указывают на то, что некоторые унаследованные полиморфные вариации в генах NER могут обуславливать предрасположенность к раку легких и, потенциально, к другим онкологическим заболеваниям.
Нефункциональная функция NER, вызванная полиморфизмом ДНК
Два важных гена в пути NER, полиморфизм которых продемонстрировал функциональное и фенотипическое влияние, – это гены XPD и XPC. XPD, также известный как ERCC2, выполняет функцию раскрытия ДНК вокруг участка повреждения в ходе NER, помимо других транскрипционных активностей. Исследования показали, что полиморфизмы в экзоне 10 (G>A) (Asp312Asn) и экзоне 23 (A>T) (Lys751Gln) связаны с генетической предрасположенностью к нескольким типам рака. Ген XPC кодирует белок, который распознает ДНК на ранней стадии пути NER. В этом гене могут возникать полиморфизмы в интроне 9 и SNPs в экзоне 15, которые также коррелируют с риском развития рака. Исследования показали, что биаллельный поли(AT) полиморфизм вставки/делеции в интроне 9 гена XPC ассоциирован с повышенным риском развития рака кожи, молочной железы и простаты, особенно среди населения Северной Индии.
Влияние на прогноз рака
Исследование наследственного рака, ксеродермы пигментной, позволило идентифицировать несколько генов, кодирующих белки в пути NER, два из которых – XPC и XPD. XP вызывается гомозиготным дефицитом репарации повреждений ДНК, вызванных ультрафиолетовым излучением (GG NER), что увеличивает риск рака кожи у пациентов в 1000 раз. У гетерозиготных пациентов риск развития рака носит спорадический характер, но может быть спрогнозирован на основе аналитической оценки полиморфизмов в генах репарации ДНК, связанных с XP, выделенных из лимфоцитов. В исследовании частоты рецидивов колоректального рака II и III стадий высокой группы риска было показано, что полиморфизм XPD (ERCC2) 2251A>C значительно коррелирует с ранним рецидивом после химиотерапии. Исследования указывают на то, что эффекты полиморфных генов NER являются аддитивными: чем выше частота вариантов, тем выше риск развития рака.
Старение
У людей и мышей мутации зародышевой линии в генах, задействованных в NER, вызывают признаки преждевременного старения. Эти гены и кодируемые ими белки включают ERCC1 (ERCC1), ERCC2 (XPD), ERCC3 (XPB), ERCC4 (XPF), ERCC5 (XPG), ERCC6 (CSB) и ERCC8 (CSA). Мыши с мутациями в ERCC1, приводящими к дефициту репарации ДНК, демонстрируют признаки ускоренного старения и имеют ограниченную продолжительность жизни. Ускоренное старение у мутантов затрагивает множество органов. Мутации в гене ERCC2 (XPD) могут приводить к различным синдромам, таким как ксеродерма пигментная (XP), трихотиодистрофия (TTD), комбинации XP и TTD (XPTTD) или комбинации XP и синдрома Кокейна (XPCS). TTD и CS оба проявляют признаки преждевременного старения. Эти признаки могут включать сенсоневральную глухоту, дегенерацию сетчатки, гипометилирование белого вещества, кальцификацию центральной нервной системы, низкий рост и кахексию (потерю подкожной жировой ткани). Фибробласты XPCS и TTD, полученные от мутантов человека и мыши с мутациями в ERCC2 (XPD), демонстрируют признаки дефектной репарации окислительных повреждений ДНК, которые могут лежать в основе симптомов сегментарного прогероида (преждевременного старения) (см. теорию повреждения ДНК при старении). Мутации в гене ERCC3 (XPB) у человека могут приводить к ксеродерме пигментной (XP) или XP в сочетании с синдромом Кокейна (XPCS). Дефицит ERCC4 (XPF) у человека приводит к различным состояниям, включая ускоренное старение. У людей мутационные дефекты в гене ERCC5 (XPG) могут вызывать либо ксеродерму пигментную (XP) как предрасполагающее к раку состояние, либо в сочетании с тяжелым расстройством нейроразвития – синдромом Кокейна (CS), либо с детским летальным цереброокулофациоскелетным синдромом. Модель мыши с мутацией в ERCC5 (XPG) проявляет признаки преждевременного старения, включая кахексию и остеопороз с выраженными дегенеративными фенотипами в печени и мозге. Мутации в гене CSA составляют около 20% случаев CS. Для людей с CSA и CSB характерны тяжелые нарушения роста и умственная отсталость после рождения, а также ускоренное старение, приводящее к преждевременной смерти в возрасте от 12 до 16 лет.
Снижение NER с возрастом
Как показано в обзоре Горбуновой и др., исследования восстановления ДНК (NER) в различных клетках и тканях молодых и пожилых людей часто демонстрируют снижение способности к NER с увеличением возраста. Это снижение может быть обусловлено уменьшением конститутивных уровней белков, задействованных в пути NER.