Введение

Микроклональное размножение или культура тканей растений – это практика быстрого увеличения количества растительного материала для получения большого числа потомков, с использованием современных методов культуры растительных тканей. Микроклональное размножение применяется для размножения широкого спектра растений, включая генетически модифицированные или выведенные традиционными методами селекции. Оно также используется для получения достаточного количества сеянцев для посадки из бессемянных растений, растений, которые плохо размножаются вегетативным способом, или в случаях, когда микроклональное размножение является более экономичным способом размножения (например, орхидеи). Ботаник Корнелльского университета Фредерик Кэмпион Стюард открыл и разработал методы микроклонального размножения и культуры растительных тканей в конце 1950-х – начале 1960-х годов.

Выбор материнского растения

Микроразмножение начинается с отбора растительного материала для размножения. Растительные ткани извлекаются из целого растения в стерильных условиях. Чистый исходный материал, свободный от вирусов и грибков, имеет важное значение для получения самых здоровых растений. После выбора растительного материала для культивирования начинается сбор эксплантов, который зависит от типа используемой ткани, включая верхушки побегов, пыльники, лепестки, пыльцу и другие растительные ткани. Затем эксплантный материал подвергается поверхностной стерилизации, обычно в несколько этапов с использованием отбеливателя и спиртовых промывок, и, наконец, промывается стерилизованной водой. Эта небольшая часть растительной ткани, иногда даже одна клетка, помещается на питательную среду, которая обычно содержит макро- и микроэлементы, воду, сахарозу в качестве источника энергии и один или несколько регуляторов роста растений (растительные гормоны). Обычно среду загущают гелеобразующим агентом, таким как агар, для создания геля, поддерживающего эксплант в процессе роста. Некоторые растения легко выращиваются на простых средах, но другим требуются более сложные среды для успешного роста; растительная ткань растет и дифференцируется в новые ткани в зависимости от состава среды. Например, среда, содержащая цитокинин, используется для формирования разветвленных побегов из почек растений.

Умножение

Умножение – это взятие образцов тканей, полученных на первом этапе, и увеличение их числа. После успешного введения и роста растительной ткани, за этапом адаптации следует этап размножения. Путем многократных повторений этого процесса, из одного исходного образца можно получить от сотен до тысяч растений. В зависимости от типа выращиваемой ткани, размножение может осуществляться различными методами и в разных средах. Если выращенный растительный материал представляет собой каллус, его можно измельчить в блендере на более мелкие части и снова культивировать на той же среде для получения большего количества каллуса. Если ткань выращивается в виде небольших растений, называемых рассадой, часто добавляют гормоны, стимулирующие образование у рассады множества боковых побегов. После формирования множества побегов, их переносят в среду для укоренения с высоким соотношением ауксина к цитокинину. После развития корней, рассаду можно использовать для закаливания.

Претрансплантация

На этом этапе выращенные побеги/саженцы подвергаются обработке для стимуляции роста корней и "закаливания". Это делается in vitro, то есть в стерильной среде, например, в "пробирке". "Закаливание" – это подготовка растений к естественным условиям произрастания. До этого момента саженцы выращивались в "идеальных" условиях, предназначенных для обеспечения быстрого роста. В силу контролируемого характера их развития, у побегов часто отсутствует полностью сформированный защитный покров. Это делает их очень восприимчивыми к болезням и неэффективными в использовании воды и энергии. Условия in vitro характеризуются высокой влажностью, и растения, выращенные в таких условиях, часто не формируют функциональную кутикулу и устьица, предотвращающие потерю влаги. После изъятия из культуры саженцам необходимо время для адаптации к более естественным условиям окружающей среды. Закаливание обычно включает постепенный переход от высокой влажности, низкой освещенности и тепла к нормальным условиям роста для данного вида.

Передача из культуры

На заключительном этапе микроклонального размножения растений рассаду извлекают из питательной среды и пересаживают в почву или (чаще) в горшечный субстрат для продолжения роста традиционными методами. Эта стадия часто объединяется со стадией предтрансплантации.

Методы

Существует много методов микроразмножения растений.

Культура меристема

В культуре меристема меристема и несколько прилегающих зачатков листьев помещаются в подходящую питательную среду, где стимулируется образование новых меристем. Эти меристемы затем разделяют и продолжают выращивать и размножать. Для получения растений меристемы извлекают из среды пролиферации и переносят на среду регенерации. Через несколько недель, когда формируется удлиненный укорененный росток, его можно пересадить в почву. Данным методом можно получить растение, свободное от болезней. Экспериментальные результаты также свидетельствуют о том, что эта техника может быть успешно использована для быстрого размножения различных видов растений, например, кокосовой пальмы, клубники, сахарного тростника.

Культура эмбрионов

При культивировании эмбриона его извлекают и помещают в питательную среду с необходимыми веществами в асептических условиях. Для быстрого и оптимального развития в саженцы его переносят в почву. Это особенно важно для получения межвидовых и межродовых гибридов, а также для преодоления эмбрионального барьера.

Культура протопластов

В культуре протопластов растительная клетка может быть изолирована с помощью ферментов, разрушающих клеточную стенку, и выращиваться в подходящей питательной среде в контролируемых условиях для регенерации растений. При благоприятных условиях протопласт формирует клеточную стенку, после чего происходит увеличение клеточного деления и дифференцировки, и он развивается в новое растение. Протопласт сначала культивируют в жидкой среде при температуре 25-28 °C с интенсивностью освещения 100-500 люкс или в темноте, а после значительного деления клеток его переносят в твердую среду, благоприятную для морфогенеза. Многие плодовые и овощные культуры хорошо реагируют на культуру протопластов.

Недостатки

Микроразмножение не всегда является идеальным способом размножения растений. Условия, ограничивающие его применение, включают:

Затраты на рабочую силу могут составлять 50–69% операционных расходов. Все растения, полученные методом микроразмножения, являются генетически идентичными клонами, что приводит к снижению общей устойчивости к болезням, поскольку все потомки могут быть восприимчивы к одним и тем же инфекциям. Зараженный образец растения может дать зараженное потомство. Это случается нечасто, так как исходные растения тщательно отбираются и проверяются, чтобы исключить культивирование растений, зараженных вирусом или грибком. Не все растения можно успешно культивировать in vitro, часто из-за того, что не известна подходящая питательная среда для их роста, или растения производят вторичные метаболиты, которые подавляют или убивают эксплант. Иногда растения или сорта не сохраняют свои сортовые признаки после культивирования тканей. Это часто зависит от типа экспланта, используемого на стадии инициации, или от возраста клеток или линии проростков. Некоторые растения очень трудно дезинфицировать от грибковых организмов. Основным ограничением использования микроразмножения для многих растений является стоимость производства; для многих видов использование семян, которые обычно свободны от болезней и производятся в больших количествах, позволяет получать растения (см. ортодоксальные семена) в больших количествах по более низкой цене. По этой причине многие селекционеры не используют микроразмножение из-за его высокой стоимости. Другие используют его для получения исходных растений, которые затем используются для размножения семян. Механизация процесса могла бы снизить затраты на рабочую силу, но добиться этого оказалось сложно, несмотря на активные попытки разработки технологических решений.

Приложения

Микроразмножение обеспечивает выращивание, хранение и поддержание большого количества растений на ограниченной площади, что делает этот процесс экономически выгодным. Микроразмножение используется для сохранения генетического материала и защиты находящихся под угрозой исчезновения видов.