Введение

Аспект молекулярной биологии
Рибосомный дисплей – это метод, используемый для проведения эволюции белков in vitro с целью создания белков, способных связываться с целевым лигандом. В процессе формируются транслированные белки, связанные с их предшествующей мРНК, которая в виде комплекса используется для связывания с иммобилизованным лигандом на этапе селекции. Гибриды мРНК-белка, демонстрирующие хорошее связывание, затем подвергаются обратной транскрипции в кДНК, а их последовательность амплифицируется методом ПЦР. Результатом является нуклеотидная последовательность, которую можно использовать для создания белков с высокой аффинностью к лиганду.

Процесс отображения рибосом

Рибосомный дисплей начинается с собственной библиотеки последовательностей ДНК, кодирующих полипептиды. Каждая последовательность транскрибируется, а затем in vitro транслируется в полипептид. Однако библиотека ДНК, кодирующая определенную библиотеку связывающих белков, генетически соединяется со спейсерной последовательностью, лишенной стоп-кодона в конце. Отсутствие стоп-кодона предотвращает связывание и активацию факторов высвобождения, что препятствует диссоциации трансляционного комплекса. Таким образом, эта спейсерная последовательность остается прикрепленной к пептидил-тРНК и занимает рибосомный туннель, позволяя интересующему белку выступать из рибосомы и сворачиваться. В результате образуется комплекс мРНК, рибосомы и белка, способный связываться с лигандом, иммобилизованным на поверхности. Этот комплекс стабилизируется понижением температуры и добавлением катионов, таких как Mg2+. В ходе последующих стадий связывания, или панинга, комплекс вводят в контакт с лигандом, связанным с поверхностью. Это можно осуществить различными способами, например, с помощью аффинной хроматографической колонки со смолой, содержащей лиганд, 96-луночной пластины с иммобилизованным поверхностным лигандом или магнитных частиц, покрытых лигандом. Комплексы, демонстрирующие хорошее связывание, иммобилизуются. Последующая элюция связывающих комплексов с использованием высоких концентраций соли, хелатирующих агентов или подвижных лигандов, которые образуют комплекс со связывающим мотивом белка, позволяет диссоциировать мРНК. Затем мРНК может быть обратной транскрипцией преобразована обратно в кДНК, подвергнута мутагенезу и итеративно вводима в процесс с возрастающим селективным давлением для выделения еще более эффективных связывающих веществ.

Преимущества дисплея рибосом

При наличии протеинового предшественника, связанного с комплексом, процесс рибосомного дисплея обходит разделение на микромассивы/пептидные бусины/в многоколодце, которое обычно используется в анализах с гибридизацией нуклеотидов, и предоставляет возможность быстро амплифицировать белки, которые связываются, без расшифровки последовательности до необходимости. Одновременно этот метод требует создания больших, концентрированных пулов последовательного разнообразия без разрывов и предотвращения деградации, гибридизации и нежелательных взаимодействий этих последовательностей, которые могли бы привести к пробелам в пространстве последовательностей. Он успешно применяется в разработке лидирующих антител и белковых терапевтических кандидатов и до сих пор широко используется в этих областях. Конкурирующими методами in vitro эволюции белков являются дисплей фагов, дисплей дрожжей, дисплей бактерий и дисплей мРНК. Пептиды (Mattheakis, Bhatt и Dow). Поскольку выполняется полностью in vitro, он имеет два основных преимущества перед другими технологиями селекции. Во-первых, разнообразие библиотеки ограничено не эффективностью трансформации бактериальных клеток, а только количеством рибосом и различных молекул мРНК, присутствующих в пробирке. Во-вторых, случайные мутации можно легко вводить после каждого раунда отбора, поскольку библиотеку не требуется трансформировать после каждого этапа диверсификации. Это облегчает направленную эволюцию связывающих белков в течение нескольких поколений. Предварительным условием для отбора белков из библиотек является связь между генотипом (РНК, ДНК) и фенотипом (белком). В рибосомном дисплее эта связь достигается во время in vitro трансляции путем стабилизации комплекса, состоящего из рибосомы, мРНК и формирующегося правильно свернутого полипептида. Рибосомные комплексы допускаются к связыванию с иммобилизованной на поверхности мишенью. Несвязавшиеся комплексы удаляются промывкой, а мРНК комплексов, демонстрирующих связывающий полипептид, может быть выделена, что делает генетическую информацию связывающих полипептидов доступной для анализа.